细胞膜片技术在软骨组织工程中的研究进展

尤奇 段小军 杨柳金瑛 李豫皖 朱喜忠 刘毅

1遵义医学院附属医院关节外科（贵州遵义 563003）

2陆军军医大学西南医院关节外科（重庆 400038）

关节软骨主要是由大量细胞外基质和包裹在其中的软骨细胞组成，其中细胞外基质主要成分是II型胶原和蛋白多糖[1]，是一种没有血管、神经、淋巴系统的结缔组织。所以关节软骨一旦损伤很难依靠自身完全修复，而关节软骨损伤后若未能及时有效处理，后期可能导致严重后遗症[2]。目前软骨缺损的修复方法很多，包括微骨折术、骨软骨移植术、软骨细胞移植术、软骨微粒移植术以及无细胞支架材料等，但由于以上每种方法均有其自身的局限性，尚不能很好地满足临床需求。1993年日本学者Okano报道了细胞膜片技术，该技术不需要蛋白酶的消化和外源性支架材料，通过细胞外基质的分泌形成膜片组织，然后将膜片用于修复组织缺损和改善器官功能[3]。目前，细胞膜片技术已成为软骨组织工程研究的热点，应用细胞膜片技术已成功构建组织工程骨、软骨、血管、心肌、角膜、胰岛等组织[4-7]，并用于治疗骨缺损、软骨缺损、角膜缺损、心肌梗塞、食管切除术后缺损等病损[8-10]。现就细胞膜片技术在软骨组织工程中的研究进展进行综述。

1 细胞膜片技术

1990年Yamada等[11]首次提出了细胞膜片技术，该技术利用温敏型聚合物-聚N异丙基丙烯酰胺（PolyN-isopropylacrylamide，PNIPAm）对培养皿进行涂层处理，不需要用胰蛋白酶对细胞进行消化就可获得完整的细胞膜片，从而用于组织工程的构建。该聚合物共价结合于培养皿底部，当培养温度＞32℃时，细胞黏附于培养皿上。当温度逐渐降低时，该聚合物逐渐由疏水状态变为亲水状态，细胞膜片也由粘附状态变为分离状态，从而获得完整的细胞膜片。然而该聚合物涂层的培养皿至少需要30分钟20℃的低温条件才能获得完整膜片，在低温条件下可能会影响细胞膜片的活性[12]，后来有研究者对PNIPAm进行修饰和处理，当培养皿温度降至20℃，细胞膜片分离的时间明显缩短[13-14]。目前，细胞膜片的制备方法很多，温敏培养系统是其中应用较多的一种，并已用于组织工程的构建[15-17]，但也有文献报道应用温敏培养皿制备的细胞膜片可能会影响细胞的聚合、分化[18-19]。近年来有文献报道了其他制作细胞膜片的方法，并取得了一定的效果，其中主要有电反应系统[20-23]、磁系统[24-25]、光反应系统[26-29]和酸碱系统（pH系统）[30-32]。此外，也有报道采用机械方法直接获取细胞膜片[33-34]。下面就不同方法制备细胞膜片进行比较。

表1 不同方法制备细胞膜片的比较

目前，细胞膜片技术广泛用于组织工程的研究，其中应用细胞膜片技术修复角膜、食道的缺损已进入临床研究阶段。Nishida等[9]报道应用自体口腔粘膜上皮细胞膜片修复角膜缺损，术后14个月随访，结果显示角膜透明度良好，视觉功能提高，无其他并发症。后来，有研究者做了类似的研究并取得了相似的结果[35]。Ohki等[36]、Takagi等[37]报道了应用细胞膜片技术治疗食管缺损并取得了良好的修复效果。相较于其他组织工程，细胞膜片技术在软骨组织工程的研究相对较少，但细胞膜片技术对于软骨缺损的修复逐渐引起了广大研究者的关注。细胞膜片保留了大量的细胞外基质，保留了外基质中的转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、WNT相关因子、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等细胞因子，有研究显示：在软骨损伤数小时后，会引起信号通路的激活，FGF信号通路[38]、TGF-β和BMP信号通路[39-40]、WNT信号通路[41]被激活后会促进软骨损伤的修复和细胞外基质的合成。2011年，日本已经批准应用细胞膜片技术修复关节软骨缺损的临床研究[42]

1.1 软骨细胞膜片

相较于其他细胞膜片，应用软骨细胞膜片修复关节软骨缺损的研究较多。Naoshi等[43]报道了软骨细胞膜片能够持续地分泌软骨细胞表型分子SOX9、II型胶原、纤维连接蛋白。最近Shimizu等[44]报道了软骨细胞膜片体内移植能够促进TGF-β1表达，促进软骨损伤的修复。Ebihara等[45]应用软骨细胞膜片修复猪的膝关节全层软骨缺损，术后进行组织学评分和番红-固绿染色等检测来评估修复效果，结果显示细胞膜片组修复效果显著好于对照组。Hayashi等[46]报道了用软骨细胞膜片治疗大鼠骨关节炎，术后4周和12周，经组织学评分和番红-固绿染色，结果显示细胞膜片组修复效果显著好于对照组。同全层软骨缺损相比，半层软骨缺损更难修复[47-48]，Kaneshiro等[49]报道将多层软骨细胞膜片叠加在一起修复兔关节软骨半层缺损，术后4周和8周，经番红-固绿和甲苯胺蓝染色，发现软骨缺损修复良好。经PCR检测发现II型胶原和蛋白多糖高表达。他们认为软骨细胞膜片能够很好地修复半层软骨缺损，是因为细胞膜片具有良好的粘附和屏障功能，能够为软骨再生提供生长因子，同时又能保护再生软骨组织免受关节腔内分解代谢因子的影响。Takaku等[50]将用荧光素标记的转基因大鼠的细胞膜片转移到普通大鼠膝关节软骨缺损处，结果发现大鼠膝关节软骨缺损修复良好，研究证实移植的细胞能够存活而且能够被监测到至少超过21个月，而且也证实移植的软骨细胞仍停留在膝关节处，并没有迁移到其他地方。

1.2 滑膜间充质干细胞膜片

自身骨软骨移植是修复骨软骨缺损的主要方法之一，而且该技术已经在临床实验中证明能够缓解关节疼痛、提高关节的运动功能，然而该技术面临着缺损边缘不愈合、界面整合不佳、移植物退变等问题[51-53]。Xu等[54]将滑膜间充质干细胞膜片复合自体骨软骨移植修复软骨缺损，术后4周和8周对修复组织进行O’Driscoll组织学评分，甲苯胺蓝、番红-固绿等染色，结果显示：同自体骨软骨移植相比，滑膜间充质干细胞膜片复合骨软骨移植能够显著改善移植物与宿主之间的界面整合以及降低移植物的退行性变。Sato等[55]将滑膜间充质干细胞复合软骨细胞膜片移植修复兔膝关节软骨缺损，术后4周和12周，对修复组织进行ICRS评分和番红-固绿染色，结果显示滑膜间充质干细胞复合软骨细胞膜片组的ICRS评分显著高于软骨细胞膜片组，番红染色显示滑膜间充质干细胞复合软骨细胞膜片组软骨组织再生明显好于其他对照组。Ando等[56]报道了应用猪滑膜间充质干细胞膜片修复其内侧股骨髁一直径为8.5 mm、深度2 mm的骨软骨缺损，术后6个月，通过大体观察、HE染色、番红-固绿染色和生物力学测试，结果显示：缺损区被新生的软骨组织填充，而且新生的软骨组织机械性能类似于正常软骨组织。近年来的相关研究表明，细胞膜片技术有望再生修复关节软骨缺损，由于单纯软骨细胞膜片或者单纯间充质干细胞膜片修复关节软骨缺损都存在一定缺陷，所以未来将两种或两种以上细胞膜片复合使用有望提高软骨损伤的修复效果。Sato等[55]报道体外培养的人软骨细胞形成的膜片很薄且难以成形，而且受到个体化差异的影响，将滑膜细胞和软骨细胞共培养可以模拟关节腔内的微环境，可以为细胞膜片的形成提供一个最优化的环境，并且已经将人滑膜细胞和软骨细胞共培养的细胞膜片用于临床膝关节软骨缺损的修复。

1.3 骨髓间充质干细胞膜片

骨髓间充质干细胞来源丰富且具有多向分化的潜能，骨髓间充质干细胞不仅具有再生修复软骨缺损的功能，而且具有潜在的抗免疫、抗炎的作用。在以前的研究中，骨髓间充质干细胞复合支架材料能够促进关节软骨缺损的修复，然而面临着界面整合不佳、新生软骨退变等问题，而界面整合不佳可能与新生软骨与宿主软骨之间缺乏产生软骨外基质的细胞有关[7]。骨髓间充质干细胞膜片能够提供大量的细胞和细胞外基质，因此，利用骨髓间充质干细胞膜片修复软骨缺损可能会促进新生软骨和宿主软骨的界面整合[57]。Chen等[57]用骨髓间充质干细胞膜片复合接种有骨髓间充质干细胞的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架修复兔膝关节软骨缺损，术后6周和12周，通过对修复组织的ICRS评分、HE染色和番红-固绿染色，结果显示细胞膜片组有大量的透明软骨生成且组织学评分显著高于接种骨髓间充质干细胞的支架组和单纯支架组，而且细胞膜片组新生软骨界面整合明显好于其他两个对照组。

在美国，软骨微粒移植已经用于临床软骨缺损的修复，但该技术面临着移植材料免疫排斥反应、纤维蛋白凝胶溶解以及再生软骨表面不光滑等问题[58]。因此，作者猜想利用骨髓间充质干细胞膜片复合软骨微粒修复关节软骨缺损，这样既避免了外来合成材料的植入，又增加了干细胞参与软骨缺损的修复，两者可能会产生相互促进、相辅相承的修复效果，一旦这种新的方法取得良好的修复效果，将对临床修复大的、复杂的软骨缺损提供一种新思路。

1.4 其他细胞膜片

Sekine等[59]报道了多层叠加的人子宫内膜腺源性间充质干细胞膜片向软骨方向分化，通过HE染色、II型胶原免疫组织化学染色以及蛋白多糖含量检测来验证成软骨分化能力，结果显示：在高细胞密度和缺氧的三维环境中，多层叠加的人子宫内膜腺源性间充质干细胞能够迅速向软骨方向分化。王东等[60]报道了应用脂肪间充质干细胞膜片复合富血小板纤维蛋白修复兔髁状突软骨缺损，术后1、2、3月，对修复组织进行大体观察、HE染色、番红-固绿染色，结果显示：膜片复合富血小板纤维蛋白组新生的软骨组织明显多于富血小板纤维蛋白组和空白对照组，而且膜片复合富血小板纤维蛋白组新生的软骨与宿主软骨界面整合更好、表面更光滑。Imaizumi等[61]报道了将诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）复合3D支架修复裸鼠气管软骨缺损，术后2周、4周、6周，通过对修复组织进行HE染色、阿利新蓝染色以及II型胶原免疫组织化学染色检测，结果显示：在11只IPSC组中，有6只软骨再生良好，而13只空白对照组和IPSC未诱导组未见软骨再生。Tani等[62]也报道了应用诱导性多能干细胞膜片治疗老年黄斑退变患者。未来，随着分子生物学和再生医学的发展，也许会有更多的细胞膜片技术应用到软骨组织工程中。

1.5 细胞膜片与支架材料

细胞膜片技术在软组织的构建中应用较多，在硬组织（骨、软骨）中应用相对较少。早前有研究者利用干细胞膜片修复骨软骨缺损时，发现无支架材料支撑的细胞膜片形成的骨软骨组织其强度和韧性尚不能满足临床需要，而且在膜片生长过程中难以控制膜片生长形态，因此，有研究者将细胞膜片复合支架材料用来构建新生骨软骨组织。Qi等[63]利用骨髓间充质干细胞膜片复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）修复兔膝关节软骨缺损，分别于术后6周和12周取材，通过组织学检测、ICRS评分以及透明质酸含量测定，膜片复合支架材料组修复效果要好于干细胞悬液复合支架材料组和单纯支架材料组。Mouthuy等[64]将PLGA制成静电纺丝膜片，将骨髓间充质干细胞膜片复合静电纺丝膜片在成软骨诱导条件下共培养21天，结果显示：膜片支架材料复合物具有钙化软骨的特点，相较于单纯干细胞膜片组，机械强度和韧性明显提高。Solorio等[65]将人骨髓间充质干细胞膜片与加载有TGF-β1的明胶微球相结合，成功构建出软骨组织。尽管现在用于构建骨软骨的支架材料很多，但还没有发现一种理想的材料能够用于临床。为了避免对于支架材料的依赖，未来优化膜片的制备技术以增加其机械性能，将不同的膜片复合使用可能成为软骨缺损修复的一种新的策略。

1.6 细胞膜片技术面临的问题

细胞膜片技术避免了传统的酶消化，保留了全部的细胞外基质，然而也面临着一些有待解决的问题：①细胞膜片技术再生的软骨组织含有大量的细胞而细胞外基质相对较少，正常软骨组织细胞外基质较多而含有的软骨细胞较少，因此再生的软骨组织机械性能可能与宿主软骨有差异。②应用现代技术制作的细胞膜片厚度还很薄，机械性能还不能满足临床需求，在使用时如果多层堆积也面临着膜片营养供应和代谢废物排出等问题。③修复较大的软骨缺损时，需要的细胞数量大，培养时间长，难以做到精确控制。因此，未来还需要优化细胞膜片的制备技术，以便增加其机械性能和可操作性。加强对膜片技术修复软骨缺损通路机制的研究，以加强在分子水平对软骨缺损修复的调控。

2 其他膜片技术

2.1 脱细胞基质膜片

组织是由细胞和细胞外基质组成，细胞外基质不仅对组织结构起支撑作用，而且对细胞的迁移增殖和分化起作用[66-67]。传统的组织工程常常利用合成材料作为支架材料，面临着支架材料降解和免疫排斥反应等问题。由于免疫排斥反应常由免疫细胞和细胞表面的免疫蛋白引起，因此脱细胞基质在异体移植中常常表现为免疫耐受[68]。Yang等[69]应用脱细胞软骨基质膜片复合骨髓间充质干细胞构建双相支架材料用于修复犬股骨内侧髁骨软骨缺损，术后3月、6月，对修复组织进行组织学评分、番红染色以及II型胶原免疫组织化学检测，结果显示：实验组组织修复和界面整合明显好于对照组。Xue等[70]应用脱细胞软骨基质膜片复合骨髓间充质干细胞移植到裸鼠皮下，术后4周，通过RTPCR检测，软骨基质膜片复合骨髓间充质干细胞组高表达糖胺聚糖、II型胶原、SOX9，而对照组骨髓间充质干细胞复合聚乙醇酸-聚乳酸组并没有表达II型胶原、SOX9。通过番红染色、甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化检测证实脱细胞软骨基质膜片组有大量的软骨组织生成，而聚乙醇酸-聚乳酸组软骨生成不明显，该研究证实了脱细胞软骨基质膜片能够诱导间充质干细胞成软骨分化，而且在术后4周没有出现骨化现象。

在传统的软骨组织工程中，软骨细胞体外增殖面临着去分化的现象，骨髓间充质干细胞复合非生物支架材料移植时会出现血管再生而引起骨化[71]。脱细胞软骨基质膜片克服了支架材料降解引起的炎症反应问题、干细胞移植的骨化问题，同时也避免了软骨细胞体外扩增去分化。然而脱细胞软骨基质膜片也面临着一些问题：①在软骨基质脱细胞的过程中，会脱去一些利于细胞迁移、增殖、分化的细胞因子；②目前应用的脱细胞方法制作的脱细胞软骨基质膜片还是比较小的膜片，还不能用于重塑大的器官。因此，未来还需改进脱细胞方法，在保证脱去细胞成分的同时，尽量保留细胞外基质中所含有的细胞因子等成分。

2.2 静电纺丝膜片

早在20世纪70年代静电纺丝技术就已经应用于生物材料的制作上，静电纺丝技术在纳米材料上的应用促进了纳米技术的兴起。静电纺丝膜片是利用静电纺丝技术将聚合物材料明胶/聚己内酯仿制成天然的细胞外基质结构。目前静电纺丝膜片已经应用于血管、肝脏等组织的再生[72-73]，Xue等[74]、Zheng等[75]报道了利用静电纺丝膜片技术制作耳软骨并取得了良好的效果。Mouthuy等[64]报道了利用PLGA制作静电纺丝膜片，同时将人骨髓间充质干细胞在温敏培养皿中诱导成膜片，将骨髓间充质干细胞膜片复合于静电纺丝膜片上共培养7天，结果显示：膜片支架材料复合体结构表现出钙化软骨的特点，机械特性较单纯骨髓间充质干细胞膜片组显著提高，适用于体内关节软骨缺损的重建。

同细胞膜片和脱细胞软骨基质膜片相比，静电纺丝膜片机械性能好、易于操作。但静电纺丝技术也面临着一些问题：①静电纺丝膜片可以传递炎症反应信号，可能会引起炎症反应。②可能会有支架材料降解物的残留。③同脱细胞软骨基质膜片相比，静电纺丝膜片没有维持软骨细胞表型和诱导干细胞分化的功能。因此，未来还需要研究如何恢复膜片的生物学性能和材料降解问题。

3 膜片技术同其他修复方法的比较

目前治疗软骨缺损的方法很多，每种方法虽能暂时缓解疼痛，改善关节活动功能，但长期效果还不能满足临床需求。近年来，随着材料学、再生医学以及相关生物化学的迅速发展，膜片技术在组织工程中的应用越来越多，未来将有着广阔的发展前景。现将膜片技术和其他软骨缺损修复技术的优缺点总结于表2。

表2 软骨缺损不同修复方法的比较

4 展望

目前膜片技术在组织工程中的应用日益增多，利用膜片技术修复角膜和食管缺损已进入临床研究阶段，在日本，利用膜片技术修复软骨缺损也已进入临床研究阶段，并取得一定进展。膜片技术虽然有很多优点，但其也面临着一些问题有待解决，未来还需将新的技术应用到膜片技术上来，以克服现在膜片技术所面临的问题。同时也应加强对细胞膜片技术修复软骨缺损的分子机制的研究，充分发挥膜片技术的优势，以便让其更好地符合临床需求。因此，在软骨组织工程中，为充分利用各种膜片的优势，将不同的膜片复合使用可能是未来软骨组织工程研究的一个新方向。