药饵投喂下诺氟沙星在凡纳滨对虾主要组织中的分布及消除规律研究

徐胜威，斯烈钢，申屠基康，杨 程，沈伟良

（宁波市海洋与渔业研究院，浙江宁波 315141）

目前进出口海产品的安全问题备受人们关注，药物的残留问题也成为重点检测的对象。在生产实践中，不仅要关注用药后水产动物代谢物对水产品安全隐患，更需重视抗菌渔药难降解问题，全方位地控制药物残留的问题，确保在加强治疗的同时做到生态环境不遭到不必要的破坏。因此根据抗菌渔药特性及药代动力学特征来制定一系列合理、科学的用药措施显得尤为重要。

诺氟沙星是一种广泛用于水产动物细菌性疾病的抗菌药，属于第三类喹诺酮类药物。其抑菌机理是通过作用于细菌的DNA旋转酶，干扰DNA的复制而产生抑菌作用。作为一种抑菌效果较好的水产药物诺氟沙星在水产领域使用较广泛，在草鱼 Ctenopharyngodon idellus[2]、中华鳖Trionyx Sinensis[3]、日本鳗鲡Anguilla japonica[4]、斑节对虾Penaeus monodon[5]等多种水产动物中均有报道。

近年来，由于凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei的高密度集约化养殖而引起的各类细菌性病害频发。诺氟沙星药物对细菌性疫病疗效普遍较好[5]，但此类抗生素的使用安全性越来越引起重视。农业部2292号公告中明文禁止了在食品动物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等4种原料药的各种盐、脂及其各种制剂。自2015年12月31日起，停止生产洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等4种原料药的各种盐、脂及其各种制剂，涉及的相关企业的兽药产品批准文号同时注销，2016年12月31日后禁止流通使用。因此开展南美白对虾诺氟沙星药物残留具有现实意义。目前，药物残留检测方法主要有高效液相色谱法和一些商品化的快速检测试剂盒。但能否在正确时间段有效检测到残留药物并估算出用药量需要有相应的基础性研究。凡纳滨对虾细菌性病害通常发病于高温季节，结合休药期的长短可估算出最佳采样期。目前，国内尚未见关于诺氟沙星在凡纳滨对虾体内药代动力学、组织分布与消除规律的报道。由于用药浓度、用药时间、鱼体规格及养殖方式的不同诺氟沙星在鱼虾体内代谢规律会有较大差异。本实验根据我国凡纳滨对虾养殖过程中实际用药浓度和用药时间研究了养殖模式下诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的药代动力学、组织分布与消除规律。为诺氟沙星在凡纳滨对虾中的代谢规律提供了理论数据，并为加强该药物的管理和监督非法使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验选用健康无疾病的凡纳滨对虾（平均体长 6.0±0.5 cm，平均体重 1.43±0.21 g）。

1.2 实验动物暂养

实验用凡纳滨对虾在盐度为 25，水温为 28.0±1.0 ℃，pH8.2±0.3 条件下在 1 m3玻璃钢桶中暂养两周，氨氮和亚硝酸盐控制在0.05 mg/L以下，暂养期间投喂不含药物的对虾饲料，实验开始前48 h进行饥饿处理。

1.3 病原菌

副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus为从患有急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾中分离。

1.4 药品与仪器

水产常用喹诺酮类药物（纯度>98%，见表1）；诺氟沙星标准品（纯度≧98.0%），乙腈为色谱纯，盐酸、无水硫酸钠和四丁基溴化铵为分析纯；高效液相色谱仪（美国Waters 2695），离心机（美国热电17R），振荡仪（IKA MS 3 digital）等。

1.5 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法（K-B法）和稀释法测定几种常见喹若酮类药物对副溶血性弧菌的抑菌效果，筛选出效果最好的一种药物，并确定抑菌浓度。

1.6 给药与取样

根据《新编渔药手册》的药物剂量说明，进行了预实验，确定诺氟沙星与饲料（粉料）按质量比为1:1 000制成颗粒饲料较为合理，控制每颗饲料重约2 mg。将实验虾放于长35 cm宽25 cm的八格塑料盒中，每格放1尾，设立实验组（投喂药饵）和对照组（投喂不含药物饵料）。实验开始时每尾虾投喂10颗饲料，分别在投喂后 0.5、1、2、4、6、8、16、24、48、96 h 等时间段取样，连续跟踪 18 d。每次取样时，对照组和实验组各取3尾虾，每尾虾取血淋巴、肝胰腺和肌肉样品称重并于-80℃保存，用于后续的药物含量测定。每次取样时统计饲料剩余量，并在1 h后将剩余药饵全部捞出，改喂不含药物的常规饲料。

1.7 样品前处理

1.7.1 血淋巴

向血样中加入200 μL酸化乙腈（乙腈：50%盐酸=2 500:20），涡旋混合，加入800 μL流动相，混匀离心后过微孔滤膜，装高效液相色谱仪专用瓶中，滤液供高效液相色谱仪测定。

1.7.2 肝胰腺和肌肉样品

向肝胰腺和肌肉样品中加入1mL酸化乙腈，加少量无水硫酸钠，涡旋振荡至充分混匀，离心3min，取上清液至10mL玻璃试管中，再向样品中加入1mL酸化乙腈，重复上述操作1次，将两次收集的上清液混合。置于氮吹仪中氮吹至所收集上清液蒸干，向玻璃试管中加入1mL流动相，混合均匀，过微孔滤膜，装高效液相色谱仪专用瓶中，滤液供高效液相色谱仪测定。

1.8 色谱条件

色谱柱 C18柱 （150 mm×4.6 mm）；乙腈：四丁基溴化铵溶液=5:95（V/V）；柱温：40 ℃；流速：1.5mL/min；激发波长：280 nm；发射波长：450 nm，进样量 20 μL。

1.9 回收率测定

取对照组的血样加10 μg/ml的诺氟沙星标准溶液50 μL，空白组的肝胰腺和肌肉组织各加10 μg/mL和1 μg/mL诺氟沙星标准溶液100 μL，每组做3个平行，每个浓度重复3次测定回收率，回收率=实测药物浓度/理论药物浓度×100%。

1.10 数据处理

用Origin75软件做出标准曲线和药时曲线，用DAS2.0软件对各组实验数据进行模型拟合和参数计算。

2 结果

2.1 药敏试验

副溶血性弧菌6种喹若酮类药物的药敏试验结果见表1，药敏纸片结果：副溶血性弧菌对诺氟沙星最敏感，其次为吡哌酸和盐酸诺氟沙星。根据抑菌圈的大小初步筛选出抑菌效果最好为诺氟沙星和吡哌酸，最小抑制浓度（MIC）实验结果显示诺氟沙星MIC为0.781 mg/L，吡哌酸MIC为1.563 mg/L。综合药敏试验结果，对副溶血性弧菌抑菌效果最好为诺氟沙星。为进一步研究诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的代谢过程，采用高效液相色谱法测定诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的药代动力学。

表1 药敏试验结果Tab.1 Results of drug sensitivity test

2.2 回收率

回收率测定结果见表2。血淋巴的药物回收率最高为87.7%，肝胰腺和肌肉组织平均回收率依次为64.15%和63.65%。

表2 诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的回收率Tab.2 The recoveries of norfloxacin in L.vannamei

2.3 药代动力学参数和药时曲线

诺氟沙星在凡纳滨对虾血淋巴、肌肉、肝胰腺中的分布半衰期（T1/2α）依次为1.047、1.204、1.951 h；消除半衰期（T1/2β）依次为 69.315、14.812、69.315 h；吸收半衰期（T1/2Ka）依次为 0.704、0.954、1.832 h；达峰时间（Tmax）依次为 1、4、4 h；达峰浓度（Cmax）依次为 13.527 5、1.904 4、698.916 7 mg/L；药时曲线下面积（AUC）依次为6.764、9.538、7 013.467 mg·h-1·L-1（表3）。

血淋巴的药时曲线在0.5～48 h内整体处于下降趋势，且在0.5～1 h内急剧下降，8 h后药物浓度接近于零；肌肉和肝胰腺的药时曲线变化趋势基本一致，在0.5～1 h内急剧下降，1～4 h缓慢上升并于4 h后开始下降；肝胰腺中下降较为缓慢，在14 d时仍检测到微量诺氟沙星，于16 d后下降为零，而肌肉组织于8 h后降为零，这与血淋巴表现一致（图1～3）。

3 讨论

喹诺酮类抗生素因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中。诺氟沙星是氟喹诺酮类药物之一，该类药物吸收较快，药物进入体内后大多在2 h内达到血药浓度最大值，且AUC值较大，生物利用度高，药效好[6]。本研究通过药敏试验，在6种喹诺酮药物的筛选中发现引起凡纳滨对虾弧菌性疾病的副溶血性弧菌对诺氟沙星最为敏感。李小义等[7]也发现了类似的结论：从患病的凡纳滨对虾肝胰腺中分离出副溶血性弧菌，通过抗生素试验，发现该菌株对包括诺氟沙星在内的多种抗生素敏感。诺氟沙星通过作用于细菌的DNA旋转酶，干扰DNA的复制达到抑菌效果，广泛用于水产动物细菌性疾病的抗菌药，对细菌出血性败血病的敏感度较高，利用该药在生产应用中效果良好[8]。

表3 诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的药代动力学参数Tab.3 Pharmacokinetic parameters of norfloxacin in L.vannamei

图1 血淋巴的药时曲线Fig.1 The norfloxacin concentrationtime curve of hemolymph

图2 肌肉的药时曲线Fig.2 The norfloxacin concentrationtime curve of muscle

图3 肝胰腺的药时曲线Fig.3 The norfloxacin concentrationtime curve of hepatopancreas

药代动力学中的 T1/2α、T1/2β、Tmax和 Cmax等是衡量药物在体内吸收速度和程度的重要参数。本实验中，诺氟沙星在血淋巴、肝胰腺、肌肉中的 T1/2α依次为 1.047、1.951、1.204 h，T1/2Ka依次为 0.704、1.832、0.954 h，T1/2β依次为69.315、69.315、14.812 h，表明诺氟沙星在血淋巴中吸收较快，其次是肌肉，在肝胰腺中吸收相对较慢，而在血淋巴和肝胰腺中残留时间较肌肉的长。房文红等[5]在斑节对虾药代研究中发现，通过一次性肌肉注射诺氟沙星溶液，当药物剂量为10 mg/kg时，T1/2α和 T1/2β分别为0.0635 h和0.612 h，这与本实验中的T1/2α和T1/2β的差异较大，此结果可能和给药方式与物种差异有关。青虾Macrobrachium nipponense在一次性肌肉注射25 mg/kg诺氟沙星后，血淋巴和肌肉 T1/2α依次为1.66 h和0.08 h，T1/2β为1.69 h和4.42 h，T1/2Ka为 1.66 h 和 0.08 h，Tmax为 1.82 h 和 0.03 h，Cmax为 6.008 mg/L 和 16.72 mg/L[9]。说明在青虾中肌肉对诺氟沙星的吸收较血淋巴快，且在肌肉中残留时间也较血淋巴长，这与肌肉注射的给药方式有关。本实验中诺氟沙星在凡纳滨对虾血淋巴、肝胰腺和肌肉组织Tmax依次为1、4、4 h，结合药时曲线，三者均在0.5～1 h内急剧下降，血淋巴的药时曲线在0.5～48 h内整体呈下降趋势，且在8 h后药物浓度接近于零，而肝胰腺和肌肉的药时曲线均在1～4 h缓慢上升并于4 h后开始下降。肝胰腺中下降较为缓慢，在16 d后药物残留才降为零，而肌肉组织于8 h后降为零，这可能是由于虾进食后药物最先进入血淋巴，而后进入肝胰腺和肌肉有关。血淋巴的药时曲线整体呈现下降趋势且在8 h后药物接近于零，肝胰腺和肌肉的药时曲线在1～4 h又出现一个上升的阶段，这是药物在组织中滞后于血淋巴并且与累积效应有关；肝胰腺在较长时间内仍能检测到一定量的诺氟沙星，这与肝脏作为解毒器官，对药物的蓄积有一定的关系。房文红等[10]研究在两种给药方式下诺氟沙星在凡纳滨对虾血淋巴中的药代动力学，发现肌肉注射药物和药饵口服给药条件下，前者药物浓度表现为迅速上升，给药后2min达到最高值，之后下降速度较快，而后者给药后诺氟沙星浓度迅速上升至4 h达到最高，随后下降又回升在12 h出现第二个药峰，这与本实验诺氟沙星在肝胰腺和肌肉的药时曲线趋势基本一致，均在4 h出现峰值，这相当于一次“自体给药”过程。关于药物吸收出现双峰或多峰现象的研究在其他动物已有研究[11]，本实验主要目的为研究诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的代谢消除时间，同时，为保证虾有一定的摄食时间，故在0.5 h内没有设置取样点，因此曲线无法呈现两个完整峰。在实际药残检测中，结合本实验诺氟沙星在凡纳滨对虾血淋巴、肝胰腺和肌肉的药代动力学参数和药时曲线，投喂过诺氟沙星的凡纳滨对虾至少应经过448℃.d后药物才会消除。