华南地区汉族人群ABCG2基因多态性与原发性痛风的相关性

罗艺，张洪德，陈思祖，徐文莉，李康，廖长征

(深圳市龙岗中心医院中心实验室，广东 深圳 518116)

痛风是尿酸盐结晶沉积于关节及其周围结缔组织而引起的最常见的炎性关节炎[1－4]，其根本原因是由于嘌呤代谢紊乱造成血尿酸水平过高或（和）尿酸排泄减少，病变主要发生在关节软骨、滑膜、骨骺、肌腱、以及血管较稀少的胶原纤维组织和肾脏等部位。流行病学调查显示：痛风发病率急剧升高并呈低龄化趋势[5]。研究表明，遗传是原发性痛风发病的重要因素之一，10%～35%的痛风患者具有家族史，且患痛风者家族成员中无症状高尿酸血症发生率约为25%～70%[6]。ABCG2是一种ATP结合转运蛋白，广泛分布于具有分泌、排泄功能的组织中，其功能异常可导致尿酸排泄能力下降[7]。亚洲、白种、非洲人群中，ABCG2与高尿酸血症和痛风的最强关联位点均为rs2231142位点，该位点可引起ABCG2蛋白141位谷氨酰胺转变为赖氨酸 (Q141K)。高分辨率熔解曲线技术(high resolution melting，HRM)是一种利用熔解温度判断产物序列的技术，借助嵌入式饱和染料对DNA有较强结合能力和很低抑制作用的特点，可实现对扩增片段序列低至1个碱基改变的高灵敏检测能力[8]。PCR产物的GC含量、长度、序列以及杂合情况决定了扩增片段熔解温度及熔解曲线的形状，现已广泛用于检测基因突变与分型的分子诊断、人类多种疾病相关遗传多态性分析等方面。目前，已有文献报道不同地域人群rs2231142位点单核苷酸多态性与痛风的相关性，而华南地区人群尚无文献报道，因此本文采用HRM技术分析rs2231142基因位点，研究其与原发性痛风相关性，为痛风的防控与治疗提供参考。

1 资料与方法

1．1 一般资料 痛风组426例样本均选自2016年5月至2016年10月期间就诊于自深圳市龙岗中心医院门诊的男性患者（21～65岁），所有患者均符合美国风湿病协会制定的痛风诊断标准；对照组200例样本均选自本院体检科就诊健康男性，排除恶性肿瘤、高尿酸、高脂血、高血压、痛风、糖尿病等疾病。本研究已通过本院伦理学委员会批准，所有参与本研究患者均知悉本试验目的。测量所有受试者血压、体重和身高并计算出体重指数。采集空腹静脉血，检测血清尿酸、尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖等生化指标。

1．2 试剂与仪器

1．2．1 核酸提取与纯度检测 全血DNA抽提试剂盒(杭州博日)；DNA浓度与纯度检测使用DN－1000（美国 Thermo Scientific）。

1．2．2 生化指标检测 C702全自动生化分析仪（瑞士Roche）

1．2．3 引物合成与PCR扩增 引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；MeltDoctor HRM Master Mix试剂盒(美国Life Technologies)；PCR扩增仪为ViiA7实时荧光定量PCR仪(美国ABI)。

1．3 方法

1．3．1 样本处理 采集 5ml EDTA抗凝外周静脉血，取200μl抽提全血基因组DNA（操作步骤严格参照说明书），并测定DNA浓度与纯度，保证核酸纯度相同的条件下使用TE缓冲液稀释至相同DNA 浓度(50ng/μl)，置 4℃保存备用。

1．3．2 引物设计与 PCR扩增 使用Primer3软件，根据rs2231142位点设计引物（见表1）并合成。使用MeltDoctor HRM Master Mix试剂盒，反应体系为：2X MeltDoctor HRM Master Mix 12．5μl，上游引物 0．5μl、下游引物 0．5μl、非标记探针 0．5μl、DNA样本1μl，去离子水补足体系总体积25μl，使用荧光定量PCR仪按照以下反应条件扩增：Taq酶热启动（95℃，10min）；变性（94℃，30s）；退火（58℃，30s）；延伸（72℃，30s）；循环 35 次，72℃终末延伸5min。在60℃～95℃进行高分辨率熔解曲线分析，温度每上升1℃采集25次荧光信号。当扩增模板上存在碱基突变时，熔解温度和熔解曲线形状与野生型的样本即会产生差别，分别设置已知型别的DNA模板作为标准对照品，通过将未知样本HRM图谱和标准品比对，即可得出样本基因型，由此可实现对已知位点的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）和突变进行基因分型。表1所示ABCG2基因rs2231142位点的扩增引物

表1 PCR反应引物及非标记探针序列

1．4 统计学处理 数据分析使用SPSS 19．0软件；正态分布资料用（±s）表示；两组间数据比较采用t检验；两组间基因型和等位基因构成比采用χ2检验；拟合优度χ2检验对痛风组、对照组SNP位点进行 Hardy－Weinberg 平衡检验；P＜0．05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 rs2231142基因分型检测结果 将样本DNA扩增产物的HRM图谱与已知基因型的标准品图谱进行比对，即可知道该样品的基因型：若某个样本仅有C等位基因的Tm值，即为CC型；仅含有A等位基因的Tm值，即AA型；若某样本既含有C等位基因又有A等位基因的Tm值，即为杂合型A/C。

图1 高分辨率熔解曲线rs2231142基因分型

2．2 rs2231142基因型与痛风发病相关性分析表2所示为对照组与痛风组rs2231142基因型与等位基因分布的对比情况，采用拟合优度χ2检验显示病例对照组中SNP位点基因型分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(P＞0．05)；对照组与痛风组CC、A/C、CC 基 因 型 携 带 频 率 分 别 为 ：59．98%、31．02%、9．00%和 30．05%、52．82%、17．14%，对照组与痛风组各基因型携带频率差异具有统计学意义（P＜0．01）；痛风组 rs2231142 A 等位基因携带频率为 43．54%，对照组为 24．05%，差异有统计学意义(P＜0．01)；AA基因携带者与A等位基因携带者痛风对比CC基因携带者与C等位基因携带者发病风险性分别提高了3．802倍和2．377倍，提示该基因位点与华南地区人群原发性痛风具有相关性。

2．3 rs2231142位点与痛风相关生理及生化指标关联性 rs2231142基因型与痛风相关生化指标进行了单因素方差分析，结果如表3所示，rs2231142多态性与收缩压、尿素氮、肌酐、尿酸等生化指标具有相关性。

3 讨论

高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)是引起肾脏损害的重要因素之一，与糖、脂代谢紊乱关系密切，是心血管疾病的独立危险因素。流行病学调查显示HUA患病率呈逐年上升趋势，目前我国HUA患者约1．2亿，约占总人口的10%。HUA与痛风的遗传模式十分复杂，是由若干主效基因和多个微效基因共同控制并与环境相互作用而产生[4，9]。阎胜利[10]等调查显示山东沿海地区40～49岁男性痛风患病率最高，尤其南方及沿海经济发达地区HUA 患病率可高达 5．0%～23．5%，且呈现年轻化的趋势，其原因可能与该地区居民摄入过多高嘌呤的海产品、动物内脏、肉类食品以及大量饮用啤酒等因素有一定相关性。ABCG2大量表达于肾近曲小管刷状缘膜上，起到排泄尿酸的作用，ABCG2基因Gln141赖氨酸位点基因突变已被证实为病因学突变。ABCG2基因赖氨酸等位基因编码的分子能够使尿酸转运能力下调约50%[11]，导致核苷酸结合结构域不稳定，从而引起蛋白质的表达降低[12]。Matsuo等[13]对705名日本痛风男性患者及1887名健康对照男性的发病年龄与基因分型进行分析，结果显示ABCG2功能严重失活者的痛风发病年龄较ABCG2功能正常者提前6．5年。多项研究[14－15]显示rs2231142多态性位点是一个重要的痛风发病遗传标志。Wang等[16]研究显示，中国汉族男性ABCG2 rs2231142位点AA基因型携带者痛风发病率对比CC基因型痛风发病率显著增高，表明该位点基因多态性与中国汉族男性原发性痛风的发病关系密切。因此，本研究仅选取男性作为研究对象。

表2 痛风组与健康对照组的rs2231142的等位基因和基因型分布例（%）

表3 rs2231142基因型与痛风相关生化指标的关联性

本研究选取626例华南地区汉族人群作为研究对象，结果显示ABCG2基因rs2231142位点，痛风患者携带高风险基因型 （AA+A/C）的比率为69．96%， 正常人群仅为 40．02%；rs2231142 基因位点各基因型在正常人和痛风患者携带频率差异均具有统计学意义（P＜0．01）。针对发病风险评估发现AA基因型携带者痛风发病风险较CC基因携带者提高3．802倍，A等位携带者发病风险与C等位基因携带者相比提高了 2．377倍。ABCG2基因的rs2231142位点多态性还影响收缩压、尿素氮、肌酐、尿酸等指标，此结果可解释痛风患者为何常合并代谢紊乱、高血压等疾病，但相关作用机制还需作深入探讨。本文所采用的HRM技术，仅需在反应体系中增加饱和荧光染料，不需使用探针即可进行基因分型，该方法实现闭管操作，有效降低污染；同时只需要一种试剂在同一平台上进行基因分型和突变扫描，因此，该技术具有操作简单、成本低廉、耗时少、误差小、高通量等优点，可将其作为痛风SNP位点快速筛查方法并推荐广泛应用于临床。