耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌qnr基因分布情况及耐药性分析

蒋沁炆 ，俞凤 ，陈艳慧 ，许秀华 ，方雪瑶 ，肖艳萍 ，曹星卫 ，钟桥石 ，胡龙华

(1、南昌市第三医院检验科，江西 南昌 330009；2、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006)

肺炎克雷伯菌是临床常见病原菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血流、伤口及颅内等人类多部位感染，是医院感染监控的重要菌株。由于碳青霉烯类抗菌药物的使用，在抗菌药物的选择压力下，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）甚至全耐药的肺炎克雷伯菌不断被发现，肺炎克雷伯菌的高分离率及高耐药性已成为临床抗感染关注的重点。据报道[1]，在耐碳青霉烯类类肠杆菌菌中，CRKP列居第一。喹诺酮类药物是第一种完全由人工合成的的一类广谱、强效的抗菌药物，其中氟喹诺酮类药物具有高效、服用方便、血药浓度高、良好的生物利用度、组织分布广和潜在毒副作用低等特点，已广泛用于临床抗感染治疗[2]。临床资料表明，随着氟喹诺酮类抗菌药物的使用，革兰阴性杆菌极易对氟喹诺酮类药物获得耐药性，传统的药物作用靶位改变和主动外排耐药机制[3]难于解释耐药率的快速上升速度。近年来发现的质粒介导的耐药基因qnr编码的蛋白能够保护喹诺酮类药物作用靶位而引起耐药。革兰阴性杆菌携带qnr基因可能是引起其对喹诺酮类耐药率快速上升的主要原因。本研究旨在对本地区临床分离的CRKP进行qnrA、qnrB、qnrS基因检测，以了解其存在分布及耐药情况。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集2016年1月-2017年3月南昌大学第二附属医院临床分离的129株碳青霉烯类抗生素耐药（亚胺培南/美洛培南）和喹诺酮类耐药（环丙沙星/左氧氟沙星）的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者相同部位重复分离株。

1.2 主要仪器和设备 全自动微生物分析仪VITEK 2-Compact及配套鉴定卡（法国生物梅里埃公司产品）；PCR仪 （杭州朗基科学仪器有限公司产品）；二氧化碳培养箱；美国Thermo Scientific公司超低温冰箱。PCR试剂、琼脂糖、DNA Marker均为北京天根生化科技有限公司产品；PCR引物由杭州擎科生物工程有限公司合成。

1.3 菌株鉴定和药敏试验 采用VITEK 2-Compact全自动微生物分析仪对所有菌株进行鉴定，采用GN16革兰阴性杆菌药敏试验卡进行药物敏感试验，质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603。药敏结果参照当年度CLSI文件标准进行判读及结果解释。替加环素药敏结果判读参照美国食品药品监督局（FDA）标准。药敏结果统计时中介归耐药。

1.4 引物序列 引物由杭州擎科生物工程有限公司合成，qnrA、qnrB、qnrS引物参照文献，具体见表1。

1.5 PCR扩增与基因检测采用煮沸法提取肺炎克雷伯菌总DNA，对qnrA、qnrB、qnrS耐药基因进行扩增。扩增体系一致，即：DNA模板、正向引物（F）、反向引物（R）各 1μl，2×mix12.5μl，用无菌三蒸水定容至25μl。实验用引物见表1。反应条件：94℃预变性 5min，94℃ 1min、66℃ 5min（退火温度各反应略 有 不 同 ）、72℃ 1min，32 个 循 环 后 72℃延 伸4min。5μl PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统观察结果并记录，并将目的产物送杭州擎科生物工程有限公司进行双向测序，测序结果经BLAST与已知序列比对以确定其基因型。

表1 PCR引物序列

1.6 统计学处理 采用WHONET5.6进行药敏数据分析。

2 结果

2.1 药敏试验结果 129株CRKP临床分离株中，对对喹诺酮类药物中环丙沙星耐药率最高，达94.6%(123/129)，其次为左氧氟沙星，耐药率为93.1%（121/129）。氨基糖苷类庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐药率较一致，对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐药率分别为60.8%(79/129)、66.2%(86/129)和61.5%(80/129)。对头孢菌素类抗菌药物耐药率均大于95%。氨曲南的耐药率为97.7%（126/129），耐药率最低为替加环素32.8%(41/125)。耐喹诺酮类抗菌药物CRKP对临床常用15种抗菌药物的耐药情况见图1。

图1 耐喹诺酮类抗菌药物CRKP对临床常用15种抗菌药物的耐药情况

2.2 qnr基因检测结果 129株CRKP检测出qnr基因阳性 98株，绝大多数为 qnrS（75.2%，97/129），仅1株为qnrB，未检出qnrA，见图2。qnrS基因阳性株的标本类型以痰液为主，占52.6%（51/96），其次为血液和中段尿，为别为19.6%（19/97）和11.3%（11/97），其余来自脓液、伤口分泌物、胆汁、CVP 导管等。主要分布科室为综合ICU18.6%（18/97）、急诊 ICU15.5%（15/97）、 神经外科 14.4%（14/97），其他分布于呼吸内科、肝胆外科等病房。

图2 qnrS基因阳性株电泳图谱，4、5号为qnrS基因阳性株，1、2、3、6、7为qnrS 基因阴性株

3 讨论

1998 年，Matinez-Martinez等[4]首次报道质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr，其编码的蛋白Qnr属于五肽重复家族，可与Ⅱ型拓扑异构酶特异性结合，导致细菌对喹诺酮类药物耐药。有研究表明，Qnr蛋白可与DNA促旋酶结合，保护喹诺酮的作用靶位，不被喹诺酮类药物抑制，从而使细菌对喹诺酮发生低水平耐药[5]。qnr基因的单独存在可使菌株对喹诺酮药物的敏感性降低，但可能并未达到具有临床意义的喹诺酮耐药水平或仅仅导致低水平的喹诺酮耐药，但携带qnr基因的菌株在喹诺酮药物的选择压力下容易发生染色体突变，或者含染色体突变的菌株在适宜的条件下可以捕获qnr基因，在这两种情况下菌株同时具有了质粒和染色体介导的喹诺酮耐药机制，从而引起高水平喹诺酮耐药[6]。

我们的研究结果显示，129株CRKP耐药及多重耐药性非常严重，临床几乎无经验抗感染药物可选，对临床常用的15种抗菌药物耐药率大于90%有10种，耐药率最低的为替加环素（32．6%），对氨基糖苷类庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐药率较一致（60%左右），对左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率也极其严重，耐药率均大于90%，这与戴尔宽[7]、周道平[8]等报道的结果类似，其对喹诺酮类药物的耐药率均大于90%甚至高达100%。而与杭亚平[2]等在2011－2012年对江西地区CRKP临床分离株中质粒介导的喹诺酮类耐药基因检测的研究中结果有所不同，这可能与近年喹诺酮类药物使用较广泛或CRKP克隆株播散有关。此次研究中发现，CRKP携带质粒介导的qnr基因检出率较高，129株CRKP中有98株携带qnr基因，与胡伟[11]等报道类似，qnr基因的检出率为＞50%，而与郑红波[12]等结果不同，其qnr检测阳性率低。98株携带qnr基因菌株中有97株为qnrS，仅1株为qnrB，未发现qnrA。此结果与罗勇[9]等报道类似，以qnrS检出为主，而与黄支密[10]等报道的结果不同，其未检出qnr基因。目前各地都未发现CRKP中携带qnrA基因的相关报道，但在碳青霉烯类抗菌药物敏感的肺炎克雷伯菌中发现有qnrA基因[13－15]。

综上所述，携带质粒介导qnr基因是CRKP临床分离株对喹诺酮类抗菌药物耐药的主要原因，质粒介导耐药基因水平传播及菌株同源性播散可能是CRKP对喹诺酮类抗菌药物耐药率快速上升的主要原因。必须强调的是，临床抗感染应以抗菌药物敏试验结果为依据，合理使用抗菌药物，以降低临床菌株的选择压力，同时临床医护工作者应加强医院感染意识，注意无菌操作及手卫生，加强消毒，防止耐药菌株的播散。