3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究

闵文光，余慧宏，魏建萍，涂智杰，吴建英，宋建新

(景德镇市疾病预防控制中心，江西 景德镇 333000)

微生物引起的食源性疾病中，志贺菌，大肠埃希菌O157与副溶血性弧菌引起的食源性疾病占据了大多数。传统检测方法的操作步骤过于繁琐，工作量大，检测周期长，不能及时为食源性疾病爆发和食物中毒提供有效的线索[5]。本研究旨在建立一种快速同时检测三种病原菌的多重PCR方法。有文献报道，志贺菌侵袭性质粒抗原H的IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]，大肠埃希菌O157的eaeA基因[3，4]均具有很高的特异性，在这些文献研究中已得到验证。通过对三种致病菌的基因进行分析，设计出各自特异性PCR引物，通过对病原学标本的合理处理，PCR反应条件的摸索，能同时对三种病原菌进行PCR扩增。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株实验所用菌株共8株，分别为志贺菌(ATCC10412)、大肠埃希菌 O157(ATCC43888)、肠道致病性大肠埃希氏菌(ATCC11775)、产肠毒素性大肠埃希菌 (ATCC35401)、 金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、单核细胞增生李斯特菌(CMCC54004)、蜡样芽孢杆菌(CMCC(B)63303)、副溶血性弧菌（ATCC17802）。所有菌株均为本实验室保藏菌株。

1.1.2 培养基LB培养液组成成份 胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、酵母提取物 5g/L，用 40g/LNaOH 调pH至7.0。

1.1.3 试剂及仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg-Cl2、10×PCR buffer购于上海生工；引物由上海生工合成；DL2000DNA Marker、溴化乙锭购于大连宝生物工程有限公司；琼脂糖为西班牙Biowest公司产品。PTC-200PCR仪为美国MJ公司产品；LEGEND MICRO 21Centrifuge高速离心机为美国Thermo Scientific公司生产；FLY-211B恒温摇床；DYY-6C电泳仪为北京六一仪器厂生产；GelDoc 2000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司生产。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据志贺菌侵袭性质粒抗原H的IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]，大肠埃希菌 O157 的 eaeA 基因[3，4]设计 3 对引物（表 1）。本实验提取3种菌株核酸为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳鉴定。

1.2.2 DNA模板的制备 将8株保藏菌株按照不同组合方式接种于5mlLB培养液中，37℃振荡培养，取菌液150μl于离心管中，12000r/min离心12min后弃上清，收集菌体，加1ml生理盐水洗涤1次，然后以100μl生理盐水悬浮菌体，沸水浴加热5min，迅速冷却后，12000r/min离心5min，上清即为DNA模板[6]。

1.2.3 大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌单独PCR扩增实验 以表1中3对引物分别对3株目的菌的DNA进行PCR扩增验证引物的有效性，PCR 反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 30s，进行 35 个循环；最后72℃延伸 5min。PCR 反应体系 （20ul）：Mg2+浓度2.0mmol/L，10 ×PCR Buffer：2μl，2.5mmol/L dNTPs 2μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.4μl，20umol/L 引物2μl，DNA 模板 2μl，加 ddH2O 补足到 20μl[6]。 PCR产物检测：各取5μl PCR产物进行琼脂糖电泳，以DL2000Marker作参照，在2%琼脂糖凝胶 （含EB 0.5μg/ml）中，200V电泳，在凝胶成像系统中观察结果。

1.2.4 引物特异性实验 以表1中3对引物分别对8株实验菌株的DNA进行PCR扩增以验证引物的特异性[6]，PCR检测方法同1.2.3中所述[6]。

1.2.5 多重PCR检测LB培养液中多种病原菌将志贺菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌O157分别、同时与其他5种病原菌 （包括肠道致病性大肠埃希菌，产肠毒素性大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特菌，蜡样芽孢杆菌）接种于LB培养液中培养[7]，所有细菌接种量为5cfu/ml，用上述PCR方法检测。

2 结果

2.1 大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌单独PCR扩增 采用LB培养液增菌后，提取3种目的菌DNA，对三种目的菌分别进行PCR扩增，（图1）。

图1 大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌单独PCR扩增结果

由图1可知，在LB培养液中增菌的大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌均能扩增出条带，其中大肠埃希菌O157和志贺菌的扩增效果较好，副溶血性弧菌的扩增条带较弱，可以加大DNA模板量增强扩增效果。

2.2 引物特异性实验 用表1中的3对引物对8株实验菌株进行PCR扩增，分析引物的特异性，结果表明，3对引物只能扩增目标基因，不会扩增非目的基因，特异性良好。

表1 志贺菌、大肠埃希菌O157、副溶血性弧菌多重PCR反应引物序列

表2 引物特异性实验结果

2.3 多重PCR检测LB培养中多种病原菌 将大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌，干扰菌(金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特菌，蜡样芽孢杆菌，肠道致病性大肠埃希菌，产肠毒素性大肠埃希菌)分别或同时接种到LB培养液中37℃振荡培养10h进行增菌[8]。实验重复3次，提取DNA进行多重PCR检测。

图2 接种LB培养液的待测菌多重PCR结果

1，4 为大肠埃希菌O157和其他干扰菌，2为副溶血性弧菌和其他干扰菌，3为志贺菌和其他干扰菌，5为大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌和5种干扰菌

从图2可以看出，接种5cfu/ml大肠埃希菌O157和其他干扰菌仅扩增出384bp的特异性条带；接种5cfu/ml副溶血性弧菌和其他干扰菌仅扩增出449bp的特异性条带；接种5cfu/ml志贺菌和其他干扰菌仅扩增出589bp的特异性条带；同时接种平均5cfu/ml大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌和其他干扰菌后，在泳道上只有3条特异性条带，而没有其他条带，表明多重PCR有良好的特异性。

3 讨论

本研究根据志贺菌IpaH基因、副溶血性弧菌t1基因、大肠埃希菌O157 eaeA基因设计特异性引物，为了验证引物的特异性，在实验中加入肠道致病性大肠埃希菌，产肠毒素性大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特菌，蜡样芽孢杆菌5种干扰菌，通过PCR扩增反应，结果得出，设计的引物有很好的特异性，同时根据参考文献，优化PCR条件，建立一种同时检测大肠埃希菌O157，志贺菌，副溶血性弧菌的多重PCR检测方法。使用LB增菌液同时培养大肠埃希菌O157，志贺菌和副溶血性弧菌，能通过多重PCR反应检测出来[9，10]。使用一种培养液同时培养3中致病菌，大大减少了增菌和模板提取的工作量，提高了检测效率。有报道称直接从样本中直接富集菌体进行PCR，这对样本要求较高，容易导致漏检，增菌后检测能显著提高阳性检出率。