水果蔬菜中7种新型生物农药残留检测方法研究

2018-08-16刘辉郑超红何艺梅朱国婵梁倩文

质量安全与检验检测 2018年4期

刘辉郑超红何艺梅朱国婵梁倩文

茂名出入境检验检疫局综合实验室广东茂名525000

生物体(果实)或其代谢产物，或者通过仿生合成，针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂[1]。此类制剂多为强极性物质，具有低毒、无公害、不易产生抗药性等特点。可分为植物源、动物源和微生物源三大类型[2-5]，目前在果蔬害虫防治方面得到广泛应用。但针对市面上常见的:印楝素、苦参碱、氧化苦参碱、烟碱、鱼藤酮等生物农药国家尚未制定残留限量检测标准，也没有标准检验方法。近年国外一些研究表明，印楝素具有遗传毒性，可引起人类精子畸形从而影响性功能和生育能力；苦参碱具有神经毒性，可影响人类的造血系统、肝脏、肾脏；鱼藤酮可能会诱发帕金森病等[6-10]。因此亟需建立一种生物农药多残留检测方法，并监控其残留水平。目前针对生物农药的检测方法主要有ELISA法、分光光度法、生物电极法、气相色谱法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法等[11-27]。本项目组利用全自动固相萃取－液相色谱串联质谱法首次建立了水果、蔬菜中印楝素、苦参碱、氧化苦参碱、烟碱、鱼藤酮、藜芦碱和井岗霉素7种生物农药的多残留检测方法，为生物农药的残留检测和监控提供了重要支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

仪器:Waters Quattro Premier XEUPLC-MS/MS，北京优兴全自动固相萃取仪；BUCHI平行蒸发仪；IKA涡旋振荡器；科导超声仪；Sigma 3-18K高速离心机。试剂:甲醇(Fisher，色谱纯)，乙腈(Fisher，色谱纯)，甲酸(FA)(Fisher，色谱纯)，氨水(GR)，乙酸(HA)(GR)。生物农药标准品(北京坛墨质检):苦参碱、烟碱、鱼藤酮、氧化苦参碱、印楝素、黎芦碱、井岗霉素。Waters MCX固相萃取小柱(60 mg，3 mL)。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Waters HILIC 1.7 μm，2.1×100 mm，柱温:40℃，进样体积:10 μL。

流动相:A 5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸(FA))，B乙腈。

表1 流动相梯度表

1.2.2 质谱条件

毛细管电压:1.0 KV，源温:120℃，脱溶剂温度:350℃，脱溶剂气流速:800(L/h)。

采集方式:ES(+)，MRM方式，各种物质的离子对信息见表2。

表2 离子对信息[28-29]

1.3 测定方法

1.3.1 样品制备

称取5.0g样品，加入20mL2%乙酸(HA)溶液，涡旋混合，超声提取10min，离心，上清液全部转移至25mL比色管中，然后用2%HA定容至25mL，取5mL定容液上全自动固相萃取仪过MCX小柱按1.3.2程序进行净化。

1.3.2 全自动固相萃取程序

收集洗脱液，蒸干，用流动相初始梯度定容至1 mL，过0.20 μm微孔滤膜后上机测试。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

本项目研究的生物农药在结构上多具有仲胺、叔胺基或醇羟基等极性基团[30]。项目组比较了非极性柱(Waters BEH C18)、中等极性柱(Waters BEH T3)和强极性柱(Waters BEH HILIC)3种色谱柱对7种新型生物农药的分离效果。发现在C18柱上除鱼藤酮和印楝素有保留外，其他5种物质均没有保留；在T3柱上除井岗霉素没有保留外，其他6种物质均有保留，但个别组分峰形较胖；在HILIC柱上7种物质均有保留，且有比较好的峰形。所以最终选择HILIC柱作为分析柱。

2.2 固相萃取机理及小柱的选择

2.2.1 反相萃取模式

在反相萃取模式下，我们选择了Waters的HLB，Agilent的Plexa、PPL、Focus、ENV和DIKMA的C8 6种非极性固相萃取小柱作为吸附柱，用浓度为50ng/mL的标准品考察了7种生物农药在酸性(pH=4)、中性(pH=7.0)和碱性(pH=9.0)条件下6种小柱对7种生物农药的保留情况(洗脱液为甲醇)。结果发现在3种条件下6种小柱对井岗霉素都没有保留，不能满足方法的要求，但除井岗霉素外，在中性或碱性条件下HLB、Plexa、Focus和ENV这4种小柱对其他物质均有不错的保留。

2.2.2 离子萃取模式

在离子模式下，我们选择了Agilent的强阳离子交换柱PCX、弱离子交换柱CBA和DIKMA的C8/SCX混合型非极性强阳离子交换柱，用浓度为50 ng/mL的标准品考察了7种生物农药在2%HA、2%FA、1%盐酸(HCL)、1%磷酸(H3PO4)、1%三氯乙酸、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(MC)(pH=4.0)6种溶液体系中7种生物农药的保留情况(洗脱液为5%氨化甲醇)(图1～图3)。

图1 PCX小柱6种溶液中7种农药回收柱图

图2 CBA小柱6种溶液中7种农药回收柱图

图3 C8/SCX小柱6种溶液中7种农药回收柱图

从图1～图3可以看出，CBA小柱在6种溶液下对7种农药大部分都没有比较好的保留；PCX和C8/SCX小柱效果相当，在2%HA和2%FA溶液中对7种农药都有比较好的保留，可以作为方法的备选模式和柱子。

2.2.3 正相萃取模式

在正相模式下，我们选择了NH4、PSA、FLORISI、Prime HLB、NH4/Carb、Carb等6种极性吸附小柱，用浓度为50 ng/mL的标准品考察了80%乙腈-水和乙腈两种溶液体系中7种生物农药在6种小柱中的保留情况。结果发现除Prime HLB在80%乙腈-水体系中对7种生物农药有比较好的保留外，其他柱子和体系对井岗霉素都没有保留。这可能与井岗霉素的结构含有大量的醇羟基，极性极大无法洗脱有关。

2.3 样品前处理方式的最终确定

根据前面的试验，PCX、C8/SCX、PrimeHLB 3种小柱可以作为方法优化小柱，2%HA、2%FA、80%乙腈-水3种溶液体系可作为前处理溶液。项目组选用小白菜为测试对像，采用加标回收方式进行考察，加标浓度为100 ng/mL。结果发现80%乙腈-水体系下PrimeHLB小柱处理后，无法去除样品中的色素，定容后颜色比较深，干扰测定；2%FA溶液处理样品后，提取液比较浑浊，不利于过柱；2%HA溶液处理后，提取液比较清晰、透明，过PCX柱处理后，样品比较干净，回收率介于80%～108%间，比较理想。所以最终选定2%HA作为提取液，PCX小柱为前处理柱。