三疣梭子蟹抗菌肽Scygonadin基因的克隆与序列分析

任海波, 李燕波, 张肖荣, 金信飞, 唐迎迎

(1. 宁波海洋研究院， 宁波 315832； 2. 宁波大学 海洋学院， 宁波 315211；3. 宁波市鄞州区咸祥镇农业技术推广站， 宁波 315141 )

甲壳动物营养丰富，味道鲜美，已成为我国沿海地区重要的水产养殖对象。其中三疣梭子蟹是大宗养殖品种，具有很高的经济价值[1]。但长期以来，养殖病害频发已成为制约蟹养殖业发展的瓶颈问题，也带来了巨大的经济损失[2]。而传统抗生素和化学药物的防治、滥用不同程度地增强了微生物的耐药性，影响了养殖的可持续发展。因此，寻找传统抗生素和化学药物的绿色、安全替代物已成为当前首要解决的课题之一。

抗菌肽(AMPs，autimicrobial peptides)已证实是甲壳动物体系免疫的重要组成部分，是一类生物体中普遍存在的具有抗菌活性的小分子多肽。因其不易产生微生物耐药性、无有害残留等优点，已被视为抗生素的有效替代品，通过向饲料中添加抗菌肽制剂应用于水产养殖业，并取得了良好的效果[3]。近年来关于三疣梭子蟹抗菌肽的研究主要散见于各位学者的研究报告中，如抗脂多糖因子[4]、scygonadin 基因[5]、Crustin基因[6]、Pthastatin基因[7]等。抗菌肽scygonadin属于除对虾抗菌肽Penaeidins、Crustins抗菌肽和抗脂多糖因子(ALPs)三类抗菌肽以外的具有抗菌功能的小肽[8]，首次从锯缘青蟹(Scyllaserrata)的雄性生殖系统中分离获得，是一种与生殖免疫相关的阴离子抗菌肽[5,9]。锯缘青蟹属梭子蟹科(Portunidae)，青蟹属(Scylla)，喜穴居近岸浅海和河口处的泥沙底内。而三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)属于梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹属 (Portunus)，一般在3～5 m深海底生活及繁殖，冬天移居到10～30 m的深海，其与锯缘青蟹同科不同属。目前三疣梭子蟹Scygonadin基因的研究尚未见报道。

本研究以三疣梭子蟹为材料，利用RT-PCR方法克隆获得三疣梭子蟹ScygonadincDNA序列，并对其进行生物信息学分析，为三疣梭子蟹免疫防御功能和Scygonadin基因功能相关研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性三疣梭子蟹购自宁波镇海水产品市场。RNA酶抑制剂、10×T4DNA Ligase Buffer、pMD18-T Vector、AMV反转录酶和DNATaq聚合酶购自TaKaRa公司；SMARTTMRACE cDNA Amplification试剂盒购自Clontech公司；胶DNA回收试剂盒(上海捷瑞)。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

称取100 mg剥离的三疣梭子蟹射精管，按照Trizol(大连宝生物)说明进行总RNA提取，并用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.2 cDNA的合成

总RNA利用Oligo dT-adaptor 为引物反转录得到第一链cDNA。cDNA置于-20℃下保存备用。

1.2.3 三疣梭子蟹Scygonadin基因核心序列的扩增

根据锯缘青蟹(Scyllaserrata)和拟穴青蟹(ScyllaParamamosain)scygonadin cDNA序列，利用Primer premier 5.0软件设计特异性引物(F45和R456)(表1)，以第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为50 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s,30个循环；72℃再延伸10 min。

1.2.4 三疣梭子蟹Scygonadin基因3′RACE和5′RACE的扩增

本研究采用SMARTTMRACE cDNA Amplification试剂盒，具体操作按照说明书的方法进行。根据得到的核心序列，以三疣梭子蟹 cDNA为模板，以adaptor和F45为引物，利用RACE技术进行3′扩增，扩增体系50 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃再延伸10 min。根据上述获得的Scygonadin 基因片段，设计两个反义链引物R375和R281，以Oligo dT-adaptor、adaptor、R375和R281为引物，通过两轮进行5′半巢氏PCR。两轮PCR均在50 μL体系下进行反应，反应条件：第一轮95℃预变性5 min；58℃退火5 min，30个循环；72℃延伸40 min。94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸3 min；72℃再延伸10 min。第二轮95℃预变性5 min；94℃变性45 s，30个循环；58℃退火45 s，72℃延伸3 min；72℃再延伸10 min。以上扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 PCR引物序列

1.2.5 产物克隆与测序

PCR产物电泳后，将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，用胶回收试剂盒进行回收纯化，回收产物与pMD18-T载体连接并转化，选取阳性克隆菌落进行测序。

1.2.6 序列分析

在NCBI上，利用在线ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)完成ORF的查找和核苷酸的翻译，利用 SignalP 4.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽切割位点预测，利用ProtParam在线软件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)进行蛋白质序列分子质量、氨基酸组成和等电点等基本性质分析。利用NCBI BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行核苷酸与氨基酸序列同源性分析，利用ClustalW2在线软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行多序列比对。

2 结果

2.1 Scygonadin基因的克隆

根据锯缘青蟹ScygonadincDNA序列设计特异性引物(F45和R456)进行RT-PCT，经测序该片段长度为400 bp。用引物adaptor和F45进行3′RACE，测序结果显示该片段长度为500 bp，与预期扩增的基因片段一致。用引物Oligo dT-adaptor，adaptor，R375和R281两对引物通过两轮PCR进行5′RACE，测序结果显示片段长度分别为400 bp(1st PCR)和300 bp(2nd PCR)。将测序得到的序列进行拼接，获得长度为549 bp的ScygonadincDNA序列(不包括polyA)，序列见图1。

利用ORF Finder软件分析核苷酸序列，结果显示该ScygonadincDNA序列包含56 bp的5′非编码区、121 bp的3′非编码区和372 bp的ORF(包括终止子TAA)。3′非编码区包括保守的信号序列(AATAAA)和34个非腺苷酸序列和多聚腺苷酸序列。该Scygonadin基因ORF区共编码123个氨基酸，利用 SignalP 4.0 Server预测，得到了一个有29个氨基酸组成的信号肽序列，信号肽的切割位点在Asn29和Lys30之间(图2)。利用ProtParam在线软件分析结果显示，Scygonadin成熟肽含有94个氨基酸残基，其中包括34个疏水性氨基酸，23个极性氨基酸，10个强碱性氨基酸，13个强酸性氨基酸。平均分子质量为10 606.1 u，pI为5.74，带有电荷-3，符合阴离子抗菌肽的要求。不稳定指数为35.07，蛋白质稳定。

图1 三疣梭子蟹Scygonadin全长cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列

ATG和TAA分别表示起始密码子和终止密码子；AATAAA为poly A加尾信号

2.2 Scygonadin基因的序列比对分析

在NCBI上搜索到三疣梭子蟹Scygonadin序列的相似序列3条，分别为锯缘青蟹Scygonadin(AAW57403)、锯缘青蟹Scygonadin2 (ABI96981)和拟穴青蟹Scygonadin1(ACY78509)，这3条序列对应的氨基酸序列与三疣梭子蟹Scygonadin氨基酸序列进行比对(图3)， 其相似性分别为68.3%、60.6%和52.4%。根据先前实验获得的日本蟳Scygonadin基因核苷酸序列和氨基酸序列，同源性比对分别为74.0%和52.0%。

3 讨论

三疣梭子蟹是我国重要的海产经济蟹类，但近年来其养殖病害的日益严重，给养殖业带来了巨大的损失。迄今为止关于三疣梭子蟹免疫防御功能的研究极少，已报道基因的三疣梭子蟹免疫相关因子仅见酚氧化酶[10]、热休克蛋白Hsp70[11]、C-type lectin like-domain(CTLD)-containing protein[12]等，抗菌肽研究尚不成熟。Scygonadin是从甲壳动物中分离并被鉴定，主要在雄性生殖系统中表达的第一个抗菌肽基因[13]，对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌具有选择性的抗菌活性[14]。

图2 利用 SignalP 4.0 Server软件预测Scygonadin信号肽的切割位点结果

图3 三疣梭子蟹Scygonadin，锯缘青蟹Scygonadin, Scygonadin2和拟穴青蟹Scygonadin氨基酸序列比对

本论文根据已知种类的cDNA同源序列，设计特异性引物，通过RT-PCR、3′和5′RACE扩增，成功分离出三疣梭子蟹目的ScygonadincDNA序列。三疣梭子蟹Scygonadin氨基酸序列与NCBI上的锯缘青蟹Scygonadin(AAW57403)、锯缘青蟹Scygonadin 2(ABI96981)和拟穴青蟹Scygonadin(ACY78509)的氨基酸序列相似性分别为68.3%、60.6%和52.4%。根据先前实验获得的日本蟳Scygonadin基因核苷酸序列和氨基酸序列，同源性比对分别为74.0%和52.0%。而基于细胞色素C氧化酶I基因(COI基因)的氨基酸序列， 三疣梭子蟹(BAC79206)与锯缘青蟹(YP002808458)和拟穴青蟹(YP002808563)之间相似性分别为97.8%和97.5%。COI基因为线粒体基因组基因，其进化速率较快，常被用于近缘物种的系统学研究[26]。因此本研究获取的基因序列应为Scygonadin基因，但其保守性较低。三疣梭子蟹Scygonadin基因序列与同属梭子蟹科的锯缘青蟹和拟穴青蟹相似性不高的原因，可能在于Scygonadin非维持细胞基本生命活动所必需的基因，其面临的自然选择压力小。而且三疣梭子蟹与锯缘青蟹和拟穴青蟹的生活环境存在差异，其生活环境中的菌群结构不同，在自然选择压力下Scygonadin基因可能为了应对不同致病菌而变异，导致其近缘物种间基因差异较大。

已有关于锯缘青蟹Scygonadin基因的研究结果显示，该基因主要在性成熟锯缘青蟹的射精管中转录表达，与其生殖免疫有关[10]，与Andropin[15]基因的表达十分相似，但该基因是否与Andropin基因一样也是雄腺特异性表达基因，不受细菌感染，而是由交配诱导表达等，有待于进一步研究[9]。因此也需要对三疣梭子蟹Scygonadin基因的体内表达特性进行研究，了解其在不同物种或不同微生物诱导前后的表达差异，以便为其免疫防御机制的研究奠定基础。并且对三疣梭子蟹和锯缘青蟹的抗菌肽Scygonadin基因在抗菌功能方面，以及对特定致病菌感染后三疣梭子蟹和锯缘青蟹体内Scygonadin基因的表达量方面进行差异性研究。