甘肃省兰州地区贝类海鲜、蔬菜水果中诺如病毒污染监测分析

李羽翡，张德荣，刘 煜，吴霞明，王建军，祖 新，段 鹏

(1甘肃省食品检验研究院，兰州 730030；2西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，兰州 730030)

诺如病毒是食源性疾病的主要病原之一，全球每年约有300万人群感染诺如病毒。诺如病毒传播途径多样，可通过粪口途径传播，也可通过摄入污染的食物和水，以及感染病人、物体或表面接触传染，并且环境抵抗力强、感染剂量低、传染性强、传播能力广[1-6]。统计结果显示，18个诺如病毒粒子就可以致病，抵抗力较弱的儿童、老人是该病毒的易感高危人群。诺如病毒极易在半封闭的场所内爆发，容易造成群体性疫情。

近年来，诺如病毒感染事件越来越受到国内外的广泛关注。我国已经有多起诺如病毒聚集性暴发事件报道，但多是基于现场流行病学分析和病人的检测数据，对污染源头、污染量，尤其是对有关食品中诺如病毒监测报道较少，部分研究数据只能借鉴国外相关报道[7-9]。

本文对兰州地区可能被该病毒污染的食品如海鲜类(牡蛎、贻贝、虾、海螺、扇贝)、生食水果(圣女果、草莓、蓝莓)、蔬菜(生菜、乳瓜)等进行抽样检测、分析与数据汇总。对于掌握兰州地区海鲜食品等诺如病毒的污染状况、发现食品安全隐患以及评价食品经营加工环节诺如病毒污染控制水平等提供基础数据及科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂盒采用Permerdesign Norovirus Genogroup 1 and 2 Genesig Easy Kit 2 Target Gene Kit，北京科奥明生物技术有限公司，配套使用oasig Lyophilised One Step QRT-PCR Mastermix 冻干型一步法qRT-PCR预混液。病毒RNA提取试剂盒(Roche High pure Viral RNA Kit)、蛋白酶K(Proteinase K，recombinant PCR Grade)，德国罗氏；诺如病毒阳性质控球，中国食品药品检定研究院；果胶酶，美国Sigma；牛肉膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸盐(PBS)缓冲液(gibco)，Life Technologies corporation；聚乙二醇(PEG8000)，上海生工生物工程股份有限公司；Tris盐酸盐(Vetec reagent grade，≥99%)，西格玛；甘氨酸、氯化钠(优级纯)，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ViiATM7实时荧光定量PCR仪(美国ABI)、MagNA Pure LC 2.0核酸提取仪(美国罗氏)、OPTI-MAIR生物安全柜(新加坡 ESCO)、MEGAFUGE8R高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔)、SIM-F140ADL制冰机(日本松下)、MAXQ420HP摇床(美国赛默飞世尔)、MS205DU电子天平(瑞士梅特勒)、电磨匀浆器、生物安全柜等。

1.3 样品采集

于2017年6月—2018年3月期间采集市售贝类海鲜(包括生蚝、贻贝、扇贝、虾、海螺等)、蔬菜水果(包括生菜、乳瓜、蓝莓、草莓、圣女果等)共计120份(表1)，样品采集原则：每个采样点采集样品不超过3件。以6～8个贝类样品作为1件样品，较小贝类，由于其消化腺也小，10～12件贝类作为1件样品，最终保证每件样品解剖后消化腺和肠道的总重量≥2.0g。蔬菜、水果样品以1 000g为1份，采集的新鲜样品应低温保存，防止变质。样品送达实验室后立即处理，若不及时处理，应冰箱保存，24h内进行处理并检测。

表1 样品采集明细

1.4 方法

1.4.1样品前处理

(1)贝类海鲜样品：取5～10个贝类进行解剖，取其消化腺和肠道总质量2.0g于15mL离心管，加入2mLPBS缓冲液、10μL浓度为20mg/mL蛋白酶K溶液，37℃，320r/min振荡1h进行消化。然后恒温水浴60℃，保持15min，后3 000g离心5min，取上清液200μL进行后续的RNA提取，提取过程采用High pure Viral RNA Kit试剂盒，操作过程按说明书进行。样品提取过程中均要加入过程控制病毒MS2噬菌体，作为外加扩增控制。

(2)蔬菜样品：将新鲜菜叶剪至2cm2左右，直接称取25g，放入带有滤膜的无菌取样袋内，加入40mL TEBG (Tris/甘氨酸/牛肉膏)buffer，室温摇晃20min，将均质袋滤膜一侧的液体全部转移至1支50mL离心管，4℃条件下，10 000×g，离心30min。离心后将上清液转移至另一离心管，并加入1/4倍体积的5×PEG/NaCl溶液，4℃条件下摇晃60min，并10 000×g，离心30min。离心结束，弃上清液，继续4℃条件下，10 000×g，离心5min压实沉淀。离心结束，向沉淀加入500μL PBS溶液溶解沉淀，进行后续的RNA提取，提取过程采用High pure Viral RNA Kit试剂盒。样品提取过程中均要加入过程控制病毒MS2噬菌体。

(3)水果样品：将水果样品剪至2cm3左右的小块，直接称取25g，放入带有滤膜的无菌取样袋内。加入30μ/mL的果胶酶溶液2mL，后续操作同蔬菜，然后进行RNA提取，提取过程采用High pure Viral RNA Kit试剂盒。样品提取过程中均要加入过程控制病毒MS2噬菌体。

1.4.2RNA提取与纯化 使用罗氏High pure Viral RNA Kit试剂盒，并严格按照试剂盒说明操作，提取物在-80℃冰箱保存备用。在RNA的提取过程中，所有样品均添加4μL外加扩增控制RNA(MS2噬菌体提取的RNA)。

1.4.3Real-time RT-PCR检测

(1)反应体系的配制：选用GI和GII两套引物探针体系分别进行扩增。反应总体系20μL，其中Mastermix 10μL，NOROVIRUS引物探针混合物1μL，过程控制病毒或外加扩增控制RNA引物探针混合物1μL、水3μL、模板RNA5μL。

(2)反应条件的设置：55℃，10 min(逆转录)；95℃，2min(预变性)；95℃，10秒(变性)；60℃，60秒(数据采集)；其中变形、数据采集为50个循环。

1.4.4标准曲线的构建 分别吸取90μL模板制备液到4个EP管中，标记为2～5；吸取10μL阳性对照到2号管，充分混匀；从2号管吸取10μL到3号管，充分混匀，依次重复上述步骤，完成梯度稀释。1～5号管则浓度梯度分别为2×105/μL、2×104/μL、2×103/μL、2×102/μL、20/μL。扩增曲线如图1所示。

图1 标准物质扩增溶解曲线

1.4.5结果的判断 结合样品Ct值、阳性对照、阴性对照、空白对照、过程控制病毒以及外加扩增控制RNA综合判定结果(表2)，防止假阳性及假阴性结果的出现。

2 结果与分析

2.1 贝类海鲜中污染监测

通过80份贝类海鲜样品的扩增产物溶解曲线分析发现，5份阳性标本均为GII型，汇总结果显示阳性样品为生蚝和贻贝，且贻贝的检出率高达20%(表3)。

图2为实际样品的扩增产物溶解曲线，对照标准曲线可以看出，阳性样品浓度在2×102～20/μL之间。由于诺如病毒致病剂量较低，10～100个病毒即可致病，因此该浓度的阳性样本足以引起一次诺如病毒感染事件。

表2 结果判读依据

表3 120份样品中诺如病毒检测结果

图2 实际样品扩增产物溶解曲线

2.2 蔬菜水果中诺如病毒污染监测

本实验采集并检测蔬菜、水果样本共计40个，未检测到阳性样品。

3 讨论

甘肃地处西北，食品中诺如病毒的检测工作尚未开展，因此，掌握兰州地区海鲜等食品中诺如病毒的污染情况及发展趋势，确定危害分布因素和可能来源具有重要意义。本研究首次对兰州地区贝类海鲜、蔬菜水果中的诺如病毒进行检测筛查，为预测诺如病毒的污染状况、了解食品安全状况及发现食品安全隐患提供了科学依据。本实验方法包含阳性对照模板，作为反应的对照及定量标准，利用阳性对照模板生成标准曲线，获得Ct值。每次实验均设置1个阳性对照，以证明实验方案中的引物、探针设计合理；反应体系、程序执行无误。同时在加样过程中，将阳性对照模板置于PCR加样室，在加完待测样品、空白对照并密封后再加入阳性对照模板，可利于避免阳性对照模板造成交叉污染。每次检测实验均设置空白对照，以水为模板，以保证所测阳性样品的真实有效，反应体系未受污染。为证明提取实验基于的生物样本为有效样本，选取大肠杆菌内源基因设计引物，探针进行提取扩增；若内源基因信号较弱，指示原始样本未含有足够的生物成分。使用MS2噬菌体过程控制病毒以及外加扩增控制MS2RNA作为核酸提取实验是否成功以及RT-PCR扩增反应是否成功的参照；综合考虑样品Ct值、阳性对照、阴性对照、空白对照、过程控制病毒以及外加扩增控制RNA的结果，最终判定结论，防止了假阳性假阴性结果的出现。

我国时有诺如病毒食物中毒爆发事件报道。但目前对诺如病毒污染食品的种类、污染水平、病毒型别的研究尚不全面[10-13]。诺如病毒在实际食品检测中含量较低，在一些样品中的回收率极低[14]，由于诺如病毒在食品中不能复制繁殖，所以在体外培养基本不能实现，在食品中更不能复制繁殖、也没有针对诺如病毒的疫苗。食品中的诺如病毒主要源自粪便、污水污染，病毒浓度均很低。检测食品中诺如病毒的方法主要是通过遗传物质扩增或抗原识别等方法，其中核酸扩增方法因灵敏度高、结果可靠等优点为多个国际机构广泛使用[15-16]。

本研究显示，兰州和沿海城市一样存在诺如病毒爆发的潜在风险，因此，要加强对食品安全管理的力度，通过各种媒体渠道广泛普及食品安全知识，提高民众预防食源性疾病的安全防控意识。相关研究单位也应更广泛的开展数据调研，从而获得更全面的食源性病毒污染状况与食品安全调查资料，为人民群众的身体健康、生命安全保驾护航。◇