青蒿素通过Nrf2/HO-1通路改善Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

众所周知，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发生是一个多因素作用的结果，包括遗传、环境、氧化应激和炎症等在内多种因素可能参与了AD的发生[1]。在这些因素中，β淀粉样蛋白(amyloid beta，Aβ)诱导的氧化应激所导致的神经元损伤和死亡是AD发生的主要原因之一[2]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是机体氧化应激时产生的主要分子。Aβ诱导的氧化应激产生的大量ROS能够对各种生物分子的结构和功能产生损害，引起DNA裂解、蛋白质氧化、脂质过氧化和信号转导的改变，最终导致细胞功能异常和凋亡[3]。因此，减少Aβ诱导的氧化应激可能是AD潜在的一种治疗方法。

青蒿素(Artemisinin)，一种倍半萜内酯，最初有中国科学家从青蒿中分离出的一种药物[4]。其被广泛用于疟疾的治疗，是目前最有效治疗疟疾的药物。除此之外，不断地有研究还发现，青蒿素还具有抗炎[5]、免疫调节[6]、抗肿瘤[7]和神经保护[8]等作用。然而，青蒿素是否在Aβ诱导的氧化应激对神经细胞毒性作用中具有保护性作用及其可能的分子机制，目前尚缺乏相关的研究。本研究将对上述内容进行研究，以期能够为Artemisinin在AD的防治方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SH-SY5Y细胞株购买自中科院细胞库;血清、DMEM培养基和青-链霉素双抗购自Hyclone公司;Artemisinin和Aβ1-42购买自美国Sigma公司;Nrf2、HO-1、Lamin B1和GAPDH抗体购买自英国Abcam公司;ROS检测荧光探针dihydroethidium(DHE)、MTT试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、PMSF 蛋白酶抑制剂、封闭液、一抗和二抗稀释液均购买自碧云天生物技术公司;HRP标记的抗兔二抗、抗鼠二抗均购自杭州华安生物技术有限公司;ECL发光试剂和PVDF膜购买自美国Millipore公司;

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y 细胞培养在包含10%血清和1%双抗的DMEM培养基中，培养装置为37 ℃含5% CO2恒温培养箱。

1.2.2 实验分组 (1)使用不同浓度(0.1% DMSO、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的Aβ1-42处理SH-SY5Y 细胞24 h后，通过MTT实验检测细胞活力，LDH细胞毒性检测实验检测细胞的受损情况。(2)使用不同浓度(0.1% DMSO、0 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L、24 μmol/L、48 μmol/L和96 μmol/L)的Artemisinin处理SH-SY5Y 细胞1 h后，然后加入Aβ1-42使其浓度为5 μmol/L，培养24 h后，MTT实验检测细胞活力，LDH实验检测细胞的受损情况。(3)SH-SY5Y细胞分为control、Aβ1-42组，control + Aβ1-42组和Artemisinin + Aβ1-42。培养24 h后，通过DHE荧光探针检测细胞内ROS水平，Western blotting检测Nrf2和HO-1蛋白的表达情况。

1.2.3 MTT检测细胞活力 SH-SY5Y细胞(3×104/每孔)被接种在96孔中，根据研究目的不同，加入不同药物处理24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)继续培养3 h后。弃去培养基，每孔加入200 μl的DMSO。充分震荡后，使用酶标仪检测每孔在570 nm下的吸光值并记录，每组设6个复空。

1.2.4 ROS的检测 SH-SY5Y细胞被接种在6孔中，根据研究目的不同，加入不同药物处理24 h后，将各组细胞加入DHE溶液使其终浓度为5 μmol/L，然后在培养箱孵育30 min。PBS漂洗3次，在荧光显微镜下检测。

1.2.5 LDH的检测 当细胞凋亡或坏死时，细胞膜结构的破坏会导致细胞内的酶释放到培养液里，这其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)。通过检测培养液中的LDH的活性，可实现对细胞毒性的定量分析，从而在一定程度上反映了细胞的受损情况。

1.2.6 Western blotting检测Nrf2和HO-1的表达 SH-SY5Y细胞被接种在6孔中，根据研究目的不同，加入不同药物处理24 h后。将各组细胞弃去培养基，PBS清洗两次，然后每组加入100 μl的裂解液并在冰上裂解30 min。随后刮去蛋白、离心和BCA法定量检测。配制10% SDS聚丙烯酰氨凝胶进行电泳、转膜和抗体孵育。次日使用ECL液进行显影，通过Image J软件对条带进行分析。

2 结 果

2.1 不同浓度的Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的毒性作用 使用不同浓度的(0.1% DMSO、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)Aβ1-42的处理SH-SY5Y细胞24 h后，通过MTT实验检测不同浓度Aβ1-42的对SH-SY5Y细胞活力的影响。MTT结果表明：与control组相比，随着Aβ1-42的浓度的增加，细胞的活力不断被抑制(P<0.001)(见图1A)。相似地，LDH实验结果也显示：与control相比，随着Aβ1-42的浓度的增加，其对细胞的毒性作用也不断增加，表明细胞的凋亡数也不断增加(P<0.001)(见图1B)。

Control表示对照组，对照组用0.1% DMSO处理，与Control组相比***P<0.001

图1 不同浓度的Aβ1-42对细胞的毒性作用

2.2 Artemisinin减弱Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的毒性作用 使用不同浓度的(0.1% DMSO、0 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L、24 μmol/L、48 μmol/L和96 μmol/L)Artemisinin处理SH-SY5Y细胞1 h后，每组加入Aβ1-42使其最终浓度为5 μmol/L，两种药物共同处理细胞24 h后进行MTT和LDH检测。MTT实验结果显示：随着Artemisinin的浓度的增加，Aβ1-42对细胞的活力抑制作用不断被减弱;在Artemisinin浓度为24 μmol/L时，作用效果最明显(P<0.001)(见图2A)。与上述结果相一致，LDH实验结果也表明：随着Artemisinin的浓度的增加，Aβ1-42对细胞的毒性作用不断被减弱，对细胞的促凋亡作用不断被抑制;在Artemisinin浓度为24 μmol/L时，作用效果最显著(P<0.001)(见图2B)。

Control表示对照组，对照组用0.1% DMSO处理;与不加Artemisinin处理组相比***P<0.001

图2 Artemisinin对SH-SY5Y细胞的保护作用

2.3 Artemisinin抑制Aβ1-42在SH-SY5Y细胞内诱导的氧化应激 将SH-SY5Y细胞分为以下4组：control组、5 μmol/L Aβ1-42组、control + 5 μmol/L Aβ1-42组和24 μmol/L Artemisinin + 5 μmol/L Aβ1-42组，各组细胞培养24 h后，通过DHE探针检测细胞内ROS的水平，来了解细胞内的氧化应激情况。免疫荧光结果统计表明：与control组相比，Aβ1-42处理明显增加细胞内的ROS水平(P<0.001)(见图3);与control + Aβ1-42组相比，Artemisinin显著抑制了Aβ1-42诱导的ROS的表达(P<0.001)(见图3)。这些结果表明：Artemisinin能够抑制Aβ1-42诱导的氧化应激。

2.4 Artemisinin上调SH-SY5Y细胞内Nrf2和HO-1蛋白的表达 将SH-SY5Y细胞分为以下4组：control组、5 μmol/L Aβ1-42组、control + 5 μmol/L Aβ1-42组和24 μmol/L Artemisinin + 5 μmol/L Aβ1-42组，细胞培养24 h后，通过Western blotting检测细胞内Nrf2和HO-1蛋白的表达水平。结果显示：与control + Aβ1-42组相比，Artemisinin显著抑制细胞质内Nrf2的表达，促进HO-1和细胞核内Nrf2的表达(见图4)。

Control表示对照组，对照组用0.1% DMSO处理***P<0.001

Control表示对照组，对照组用0.1% DMSO处理

3 讨 论

AD是一种常见的慢性进行性神经系统退行性病变，患者常表现为认知功能障碍和记忆退化。众所周知，Aβ的异常聚集是AD最显著的特点，与AD的发生密切相关。大量积累的Aβ不仅能够导致老年斑的形成，而且还可以导致线粒体功能异常，这些异常包括能量代谢紊乱、线粒体去极化和氧化应激等。氧化应激是细胞死亡的关键机制之一;氧化应激时产生的大量ROS可以直接或间接损害细胞内脂质、核酸和蛋白质的功能。而且，研究还证实：氧化应激是许多退行性疾病最主要的病理生理学基础，这其中就包括AD[9]。因此，氧化应激是导致AD发生的主要原因之一，也是其潜在的治疗靶点[10]。目前，已有大量的研究发现：包括姜黄素[11]、维生素E[12]和白藜芦醇[13]在内的多种抗氧化药物具有神经保护作用，能够减弱Aβ诱导的氧化应激对神经细胞的毒性作用和促凋亡作用。

Artemisinin是一种广泛用于疟疾治疗的药物。但是，最近的研究发现Artemisinin具有抗氧化作用，其对神经细胞PC12具有营养和保护作用[8，14]。除此之外，Zeng等[15]也报道：Artemisinin能够通过ERK1/2通路抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡，并指出Artemisinin有希望用于AD的防治。和上述结果相一致，在我们目前的研究中，我们发现Aβ1-42能够以浓度依赖的方式抑制SH-SY5Y细胞的活力，促进其凋亡;Artemisinin能够减轻Aβ1-42对SH-SY5Y细胞活力的抑制，抑制Aβ1-42对 SH-SY5Y细胞的毒性作用。我们进一步的研究还发现：Artemisinin能够减少Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞内的ROS水平，抑制Aβ1-42诱导的氧化应激。

对于Artemisinin抑制Aβ1-42在SH-SY5Y细胞内诱导的氧化应激的分子机制，目前尚缺乏相关的报道。核转录因子E2相关因子 2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是一个核转录因子，参与激活多种与细胞保护和解毒相关基因的表达。在氧化应激条件下Nrf2将被激活，这将导致Nrf2从细胞质转位到细胞核，然后结合到抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)上，从而激活II相解毒酶和抗氧化酶相关基因的转录，这其中就包括血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)[16]。而之前的研究已经证实：HO-1在 Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性作用过程中具有保护作用[17]。除此之外，多项研究还表明：激活的Nrf2对神经退行性疾病具有保护作用，其有可能成为那些发病与氧化应激相关疾病的治疗靶点[18]。因此，这些都促使我们在本研究中调查Artemisinin对Nrf2和HO-1表达的影响。我们的实验发现，Artemisinin能够诱导SH-SY5Y细胞核内Nrf2的表达，抑制胞质内Nrf2的表达，同时上调其下游靶基因HO-1的表达。巧合的是，之前的研究也发现，Artemether(一种青蒿素的衍生物)能够通过上调小神经胶质细胞BV2中Nrf2和HO-1的表达，从而抑制神经炎症[19]。

总之，本研究发现Artemisinin在Aβ1-42诱导的氧化应激对SH-SY5Y细胞毒性作用过程中具有保护作用，其有可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥上述作用。期望我们的研究结果为Artemisinin应用于AD的治疗提供理论依据。