高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物残留量的不确定度评定

叶文姣

摘要 本文通过高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物残留量，同时依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059—1999），分析其不确定度来源和建立数学模型，量化不确定度分量，计算合成标准不确定度及扩展不确定度。结果显示，样品中喹乙醇代谢物的含量为（80.01±0.31）μg/kg，扩展不确定度为0.31 μg/kg（k=2），其中，标准物质的不确定度为主要来源。

关键词 高效液相色谱法；水产品；喹乙醇代谢物；不确定度评定

中图分类号 O657.7+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）11-0243-02

喹乙醇又称喹酰胺醇，属于喹噁啉类动物专用药，具有广谱抗菌、促进蛋白同化、加快动物生长及提高饲料转化率的作用，广泛应用于水产养殖业[1-3]。其在动物体内的主要代谢物为3-甲基喹噁啉-2-羟酸（MQCA），具有明显的蓄积毒性，对人体也有致畸、致癌、致突变作用[4]。因此，美国和欧盟均禁止喹乙醇作为饲料添加剂。《中国兽药典》（2005版）也明确规定禁止喹乙醇用于家禽及水产养殖业。

不确定度可用于衡量化学分析中测量结果的可信程度，是评定检测数据准确度与真实性的重要指标。通过分析不确定度的来源、分量大小，可以明确测定过程中各因素对测量结果不确定度的影响程度，进而提高测量结果的准确性[5-7]。

本试验采用农业部1077号公告-5-2008《水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法》进行测定，当MQCA的检测结果在限量值附近时，对测定过程中的不确定度评定是判定样品合格与否的重要依据[8]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，配紫外-可见光检测器（美国Agilent公司）。采用农业部1077号公告-5-2008《水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法》进行样品提取与纯化。色谱条件为色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇+1.0%甲酸水溶液（50+50）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：50 μL；检测波长：320 nm。

1.2 标准工作曲线的制作

准确称取MQCA标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL置于棕色容量瓶中，配成浓度为100 mg/L的标准储备液。再用流动相稀释成为0.01、0.05、0.25、0.50、1.00 μg/mL的系列标准溶液，供高效液相色谱分析待用，然后用外标法定量。

1.3 数学模型

数学模型如下：

2 结果与分析

2.1 不确定度的来源分析

重复测定引入的相对标准不确定度urel（1）主要为样品处理过程的一致性，样品称量引入的相对标准不确定度urel（2）主要为天平准确性和称量过程变动性，样品定容引入的相对标准不确定度urel（3）包括样品定容所用吸量管，标准物质引入的不确定度urel（4）包含标准物质纯度、标准储备液和标准工作液配制过程引入的不确定度，其他不确定度还有高效液相色谱仪测量的不确定度urel（5）和回收率影响引入的不确定度urel（6）。

2.2 不确定度的分量评定

2.2.1 重复测定引入的相对标准不确定度。对同一阴性试样加标样品进行前处理和色谱测定，平行测定9次，其结果见表1。

2.2.2 样品称量引入的相对标准不确定度。样品称量所用天平为最小分度值为0.01 g的电子天平，准确称量m=5.00 g。根据校准证书，测量结果的扩展不确定度U=0.01 g，k=2，则样品称量引入的相对标准不确定度urel（2）=0.01/2/5.00=0.001。

2.2.3 样品定容引入的相对标准不确定度。样品经提取、氮气吹干后，残留物用1 mL流动相定容。定容采用1 mL单标线吸量管（A级），根据校准证书可知，其扩展不确定度U=0.02 mL，k=2，则样品定容引入的相对标准不确定度urel（3）=0.02/2/1=0.01。

2.2.4 标准物质的不确定度。标准物质不确定度包含标准物质纯度、标准储备液和标准工作液配制过程引入的不确定度。

（1）标准物质纯度引入的不确定度评定。标准物质MQCA由Dr.Ehrenstorfer提供，根据标准物质证书提供的信息，MQCA纯度为99.0%，不确定度为±0.5%，在95%的置信概率下，包含因子 k=2，属 B类评定，则标准物质纯度相对标准不确定度：urel（4.1）=0.5%/2/99.0%=0.002 525。

（2）標准储备液配制过程引入的不确定度评定。标准储备液的配制过程是精确称取 0.010 0 g MQCA，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，质量浓度为100 mg/L。根据称量使用的电子天平校准证书，扩展不确定度U=0.003 0 g，包含因子k=2，称标样量为0.010 0 g，则其相对标准不确定度urel（4.2.1）=0.003 0 g/2/0.010 0 g=0.150 0。

该过程使用的玻璃量具按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）的校准依据[9]，得到扩展不确定度U=0.04 mL，k=2。100 mL容量瓶（A级）的相对不确定度urel（4.2.2）=0.04 mL /2/100 mL=0.000 2。因此，标准储备液引入的相对不确定度为：

（3）标准工作液配制过程产生的不确定度评定。标准工作液是由MQCA标准储备液逐级稀释得到的质量浓度分别为0.005、0.010、0.050、0.500、1.000 μg/mL。标准工作液制备过程使用了一系列玻璃量具，其扩展不确定度及扩展因子见表2。因此，标准工作液引入的相对不确定度为：

综合以上3项，标准物质的相对标准不确定度为：

2.2.5 高效液相色谱仪测量的不确定度。由Agilent 1200高效液相色谱仪校准证书得到仪器测量的扩展不确定度U=5%，k=2，则其相对标准不确定度urel（5）=5%/2=0.025。

2.2.6 回收率影响产生的相对标准不确定度。样品在前处理过程中，因乙酸乙酯反复提取、氮气吹干及光照、温度、人员操作、进样检测仪器误差等原因产生损失。本文以回收率偏差产生的相对标准不确定度urel（6）来计算样品前处理中其他因素产生的不确定度。添加浓度为80 μg/kg，n=9。检测项目为MQCA，回收率范围70.73%～83.7%，回收率标准偏差（S）4.315 7%，平均回收率74.98%，相对标准不确定度urel（6）0.19 19。

使用t检验法检验平均回收率与其期望值1.0的差异，

2.3 合成标准不确定度

按公式对以上分量分成，其合成相对标准不确定度为：

2.4 扩展不确定度

取置信水平95%，k=2，则水产品中MQCA测定的扩展不确定度为：

U=k×urel（x）=2 ×0.155 2=0.31。

2.5 测定结果

试验采用高效液相色谱法对水产品中MQCA残留量进行测定，当取样量为5.00 g，k=2（95%置信度），试验测得样品中MQCA的最佳估算值为80.01 μg/kg。因此，测量结果报告为（80.01±0.31）μg/kg。

3 结论

本文对高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物残留量的不确定度来源进行全面分析，将各不确定度的分量进行比较分析，结果发现，标准物质的不确定度对测定结果不确定度的影响最大，其次为高效液相色谱仪测量的不确定度，其他因素影响较小。因此，在测定过程中，为获得较小的不确定度，应进一步规范标准物质的配制，尽量选取纯度较高的标准品，使用A级玻璃量具，定期对天平及高效液相色谱仪等仪器进行维护保养与校准，从而提高试验操作的规范性与测定结果的准确性。

4 参考文献

[1] 易锡斌，裘立群，刘世琦，等.液相色谱-串联质谱同时测定禽肉组织中盐酸金刚烷胺、盐酸金刚乙胺、地塞米松、替米考星及喹乙醇代谢物的残留量[J].分析测试学报，2015，34（3）：346-351.

[2] 肖利龙，花錦.超高效液相色谱-串联质谱法测定兔肉中喹乙醇代谢物残留量[J].农产品加工，2015（24）：53-57.

[3] 万译文，黄向荣，索纹纹，等.固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物的含量[J].湖南饲料，2014（4）：16-18.

[4] 彭玉芬，蔡勤仁，薛良辰，等.喹乙醇在鲫体内消除规律的研究[J].中国兽药杂志，2014，48（6）：36-39.

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[6] 王吉祥，张学忠，王亚琴，等.气相色谱法和气相色谱-质谱法测定茶叶中联苯菊酯的不确定度评定[J].食品科学，2014，35（12）：200-203.

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[8] 中华人民共和国农业部.水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法：农业部1077号公告-5-2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[9] 国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量具检定规程：JJG l96-2006[S].北京：中国计量出版社，2007.