玉米Mutator转座子系统的应用及展望

高志勇 谢恒星 李吉锋 刘史力

摘要：转座子标签法是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术，是一种利用TEs插入高等植物基因组中造成基因突变，然后通过分离TEs插入的旁邻序列，克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物的功能基因组学研究中十分有用。玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统三大类。其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围，引起的正向突变频率为10-5～10-4，比野生玉米高出近30倍，所引起的突變大部分为隐性突变。由Mutator转座子引起的突变，可以通过TAIL-PCR的方法，对相关的突变基因进行克隆。当前通过这种方法，已经克隆出一些重要的基因。本文主要介绍了Mutator转座子的应用，并对Mutator转座子系统的研究前景进行了展望。

关键词：玉米；Mutator转座子；应用；展望

中图分类号：S513.035.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0168-05

Abstract The transposon tagging is a very effective molecular biology technology developed in recent years. It causes gene mutation through TEs insertion into the genomes of higher plants， and then the mutanted genes can be cloned by isolating the flanking sequence of TEs. This strategy is very useful in the study of the functional genomics of higher plants. The main systems of maize transposon are En/Spm， Ac/Ds and Mutator ones. Among them， the Mutator transposon was prone to inserting within or around the gene； the positive mutation frequency was 10-5～10-4， which was nearly 30 times higher than that of the wild corn； and most of the mutations were recessive. The mutation can also be cloned by TAIL-PCR. Now by this method， some important genes have been cloned. In this paper， we mainly introduced the application of Mutator system， and discussed the research prospect of Mutator transposon system.

Keywords Maize； Mutator transposon； Application； Prospect

1951年，McClintock发现了玉米中的控制元件，后被命名为转座元件或转座子（transposon），在化学本质上，转座子是基因组中的一段DNA序列[1]。随后，细菌、酵母、高等动植物中的转座元件也陆续被发现。基因组中的转座子能从其原位点上复制或断裂下来，通过环化，插入其他位点[2]。转座子的发现大大推进了分子生物学的发展。了解转座子的结构，有助于解析生物遗传进化的具体机制，为生物学研究提供更加方便的工具。

玉米中的转座子系统有三大类，即En/Spm系统[3]、Ac/Ds系统[4]和Mutator（Mu）系统[5]，其中诱变能力最高的是Mu转座子系统[6]。Mu转座子可插入到基因的内部及周围，多引起隐性突变[7]。通过TAIL-PCR可以克隆出相应的突变基因。1984年，采用转座子标签法，分离出了玉米的bronze基因，此后，通过这种方法，克隆出了更多基因。基因组内的Mu转座子，一般有较多的拷贝，所引起的突变常发生在非连锁区域，引起表型突变。由于Mu转座子的特有性质和用途，使其成为目前分子生物学研究的一个重要焦点[8]。在反向遗传学的研究中，Mu转座子起到了重要的作用[9]。

在三大粮食作物（玉米、水稻、小麦）中，玉米年产量最高，现为世界第一大农作物[10]。它不仅是重要的粮食和饲料作物，还是重要的食品工业原料和能源植物[11]。玉米的生产，在维护世界粮食安全和全球经济稳定发展中，都占有重要的地位[12]。分子生物学技术的快速发展，推进完成了玉米基因组序列测序，相应地推进了玉米功能基因组学研究，以及玉米种质资源创制和分子育种研究。在基因功能的研究中，突变体是最直接有效的材料[13]，而在创制玉米突变体库中，Mu转座子系统发挥着重要的作用。

1 Mu转座子的分类及特征

1.1 Mu转座子的分类

Mu转座子家族包括两个大类，即自主型的MuDR因子和非自主型因子。根据Mu插入片段内部序列的特异性，可把Mu插入片段分为6个亚族，即Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7、Mu8、MuDR/Mu5[6]。这其中，把早先命名的MuA2、MuR1、Mu9和Cy统一划归为MuDR亚族，它们自身能编码发生转座所需要的蛋白质；非自主型因子主要有Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7和Mu8，这一类因子不能自主转座，只有在MuDR同时存在时，才能发生转座。非自主型因子会因为自主型因子的存在而变得不稳定。后续的研究中，在2002年，Charles等又发现了3种Mu因子，包括Mu10、Mu11和Mu12[14]；2011年，Tan等在玉米的UniformMu家系中，发现了转座因子Mu13[8]，这是一种具有活性的转座因子。

1.2 Mu转座子活性

Mu转座子发生转座的频率很高[15]，可以发生在体细胞和生殖细胞。如果在体细胞中发生转座子切除和插入，突变就可在当代发生，容易发生回复突变，不可遗传；而如果在前减数分裂细胞和配子中发生转座，则回复突变的发生频率就相对较低，通常能遗传。因此，在评估Mu转座子的活性时，一般要根据其家系与自交系的杂交后代进行自交后，用所出现的突变数量进行衡量。统计时，对质量性状突变，统计数据比较准确；而对于数量性状突变，环境因素的影响较大，使得统计结果可靠性较低[16]。

1.3 Mu插入位点特征

Mu虽然能在任何品系的基因组中引起插入突变，但不同的遗传背景会影响Mu因子的转座，并且在不同的基因中，突变频率可相差8倍以上[17]。Mu转座子插入在基因组中有着一定的偏好性，可插入到启动子、5′非转录区、外显子和内含子中。Mu转座子插入的靶位点序列，是转座酶识别并发生错切的特异序列[18]。通常情况下，Mu转座子插入对近5′末端的转录起始位点有最强的偏好性[18]。

2 Mu转座子标签插入位点侧翼序列的获得方法

2.1 热不对称交错PCR

对已知序列的侧翼序列进行扩增时，一般采用热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）方法。TAIL-PCR方法是一种染色体步移技术，首先运用在分离黏粒（P1）载体和酵母人工染色体插入片段末端序列，后用于转座子插入位点侧翼序列的测定。在TAIL-PCR中，利用嵌套的3个特异性引物，分别同简并引物組合，进行连续的PCR循环，采取不同的退火温度，选择性地扩增出目标片段，所得到的扩增片段，可直接用作测序模板或探针标记。试验过程中，首先根据DNA的已知序列，设计3条特异引物（special primer，SP），要求SP要同向且退火温度较高，结合退火温度较低的简并引物（可以设计多条，AP1、AP2、AP3……），进行热不对称的PCR 反应。一般情况下，简并引物至少要有一种，能利用退火温度的差异，同特异性引物之间进行热不对称的PCR 反应。通常经过3次巢式 PCR 反应后，便可得到已知序列的侧翼序列。在一次试验中所获得的扩增产物的长度，如果满足不了试验的要求，可以再依据第一次步移所获得的序列信息，接着进行侧翼序列的扩增[19]。

2.2 MuTAIL-PCR

根据Mu转座子的TIR序列，Settles等[20]进行了特异性巢式引物的设计，通过优化TAIL-PCR，提出了MuTAIL-PCR的方法，可以对Mu因子插入靶位点侧翼序列进行专一性扩增。MuTAIL-PCR方法简单，程序较少，应用方便。其流程原理图[21]如图1。

刘文婷等[21]利用优化的MuTAIL-PCR 技术，扩增出105 条序列，经生物信息学分析，其中的99 条为Mu转座子的侧翼序列，阳性率达到94.2%，这个结果显示，利用MuTAIL-PCR技术，可有效地扩增出Mu转座子插入位点的侧翼序列。

3 Mu转座子系统的应用

Mu转座子具有较高的正向突变率，倾向于插入基因富含区和低拷贝的序列区，因而从发现Mu转座子开始，其在玉米功能基因组学的研究中，显示出越来越广泛的应用[22]。

3.1 诱发基因突变

插入到功能基因附近或内部的因子，都有可能改变基因的功能，引起可见表型的基因突变。在相对较少的群体内，Mu转座子可以诱发覆盖全基因组的大量突变体。因为Mu转座子具有比较保守的TIR，所以可以根据TIR 进行PCR 引物的设计，对Mu转座子诱发的插入突变群体进行高效的检测[23]。Mu转座子可插入到基因的任何区域，包括启动子、内含子、外显子等区域，引起基因的表达、蛋白质结构发生改变，最终影响其功能[14]。由于Mu转座子的这些特征，使得其有效地用于创建玉米突变体库和进行突变基因分离。

通过Mu转座子介导，已成功地创建了玉米突变体库[24]。已使用过的构建玉米突变体库的方法中，有物理、化学、农杆菌介导的T-DNA和转座子插入突变等多种方法[25]，从所得的试验结果来看， Mu转座子具有较高的诱变频率、低插入位点偏爱性和基因组内拷贝数多等特点。对所获得的Mu转座子诱导的突变体，要进行Mu转座子插入位点侧翼序列的生物信息学分析，方能预测突变基因功能。当前，有多种分离Mu转座子插入侧翼序列的方法[26]，常用的有PCR步移技术、反向PCR技术[27]、TAIL-PCR技术、AFLP技术[28]等。

有研究者应用Mu转座子系统，成功地构建了许多玉米突变体库[29]。1995年，美国先锋公司将Mu转座子第一个应用其中，成功地构建了玉米性状利用系统（trait utility system for corn， TUSC），并筛选出了几百个由Mu转座子插入引起的突变体。May等[30]公开征集了含Mu转座子的40 000 个玉米家系，构建了玉米定向诱变数据库（maize targeted mutagenesis database， MTMdB）。Fernandes等[17]利用基因工程化的RescueMu，将其转移到玉米品系中后，通过和Mu品系进行杂交，使Mu因子发生转座，得到了RescueMu序列数据库。在含有Mu转座子的W22 回交群体（UniformMu）中，McCarty等[31]通过DNA微阵列方法，筛选出了2 000 多个籽粒突变品系。国内的研究中，引进了具有活性Mu转座子的材料作为供体，与本地优良玉米自交系受体进行杂交，获得了大型插入诱变M1群体[21]。采用田间突变型鉴定、室内籽粒性状考察等方法，评价了Mu转座子的转座频率，并利用优化的MuTAIL-PCR技术[20]扩增、克隆、测序、生物信息学分析靶位点侧翼序列，构建了我国第一个玉米Mu转座子介导的插入突变体库。通过一个新的不依赖组织培养的玉米转基因技术体系，利用农杆菌介导的玉米合子转化方法，获得了转基因植株及后代。雌穗平均结实率为39%，合子转化频率达1%以上，并且转化的基因可以遗传[32]。

3.2 基因克隆及功能研究的標签

转座子标签法是筛选由于基因内发生转座子插入而导致突变表型的一种研究方法。利用分子生物学技术，对包含转座子的突变基因进行确定，再应用突变基因的部分序列，进行探针制备，用于分子杂交，把该基因的剩余片段从基因组文库中筛选出来，对其进行全序列测定。获得的基因全序列，一方面要对序列进行生物信息学分析，以获得基因的结构和可能的理论生物学功能；另一方面对序列进行载体构建及遗传转化，鉴定出该基因的实际生物学功能。

通过Mu突变体库已经成功分离克隆了诸多基因[17]。在利用Mu突变体库筛选甜玉米突变体的研究中，加速了甜玉米新种质的创制，并推进了对玉米胚乳发育与淀粉合成机制的认识[33]。陈果等[34]利用Mu转座子鉴定了5个响应干旱胁迫的玉米蛋白磷酸酶基因；新近的研究，对玉米ZmCIPK23基因Mu插入突变体进行了有效鉴定[35]。

4 Mu转座子系统研究展望

在Mu转座子的研究中，发现自主性转座因子MuDR有着重大的意义，围绕MuDR 因子，今后还需要进一步开展一系列的系统研究工作，涉及到Mu转座子高频转座的机理，以及MuDR的表观遗传机理等。Mu转座子可以进行体细胞插入、共抑制，还具有较低的回复突变频率，这些都增加了Mu转座子系统研究的复杂性，要有效地进行这些研究工作，必须有创造性的思维。研究Mu因子同其寄主在进化过程中的相互关系，也有着重大的意义。利用转基因的方法，将Mu因子直接导入异源植物中，是一个困难重重但意义远大的课题，如果可以把活性Mu因子进行转化，那么Mu因子就可以作为有效的工具，应用于其它异源物种的基因诱变，构建异源物种的Mu转座子插入突变体库，开展基因分离等研究工作。对转座活性抑制位点Muk促使MuDR产生沉默的机制，特别在基因转录水平上，需要进行更深入的探讨。所有这些研究成果，必将对分子生物学的发展起到巨大的促进作用[36]。

当前，拟南芥和水稻的基因组草图已构建成功，玉米基因组的测序也已完成[37]。面对这些大量的植物基因组序列信息，揭示各基因的具体功能意义重大[38]。要充分利用Mu因子的存在广泛、拷贝数高等优势，使Mu因子标签法在分离克隆植物基因的研究中发挥出更加有效的作用。到目前为止，Mu转座子是已发现的转座活性最高、诱变能力最强的植物转座因子，虽然对其转座的调控机理还知道的较少，但在进行玉米插入诱变、分离克隆基因中，Mu转座子已成为重要的研究方法。伴随着分子生物学的快速发展及对Mu转座子特征和作用机理的深入研究，Mu因子系统必将在功能基因组学研究上展示出更大的作用。

参 考 文 献：

[1] McClintock B. The significance of responses of the genome to challenge[J]. Science，1984，226：792-801.

[2] 赵寿元， 乔守怡. 现代遗传学[M]. 北京： 高等教育出版社， 2001.

[3] 史桂荣， 祁永红， 齐玫馨. 玉米转座子spm的分子遗传学的概述[J]. 黑龙江农业科学， 1993（5）：48-50.

[4] Cowperthwaite M， Park W， Xu Z， et al. Use of the transposon Ac as a gene-searching engine in the maize genome [J]. The Plant Cell， 2002， 14（3）： 713-726.

[5] 高友军， 刘文婷， 陶勇生， 等. 玉米Mu转座因子及其应用[J]. 作物学报， 2006， 32（8）： 1236-1243.

[6] Bennetzen J， Springer P， Cresse A， et al. Specificity and regulation of the Mutator transposable element system in maize [J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 1993， 12（1/2）：57-95.

[7] Cresse A D， Hulbert S H， Brown W E， et al. Mu1-related transposable elements of maize preferentially insert into low copy number DNA [J]. Genetics， 1995， 140（1）： 315-324.

[8] Tan B C， Chen Z， Shen Y， et al. Identification of an active new Mutator transposable element in maize [J]. G3： Genes， Genomes， Genetics， 2011， 1（4）： 293-302.

[9] Gutierrez-Marcos J F， Dal Par M， Giulini A， et al. Empty pericarp4 encodes a mitochondrion-targeted pentatricopeptide repeat protein necessary for seed development and plant growth in maize [J]. The Plant Cell， 2007， 19（1）： 196-210.

[10]Long S P， Zhu X G， Naidu S L， et al. Can improvement in photosynthesis increase crop yields？ [J]. Plant， Cell & Environment， 2006， 29（3）： 315-330.

[11]Carpita N C， Mccann M C. Maize and sorghum： genetic resources for bioenergy grasses [J]. Trends in Plant Science， 2008， 13（8）： 415-420.

[12]Sivakumar G， Vail D R， Xu J， et al. Bioethanol and biodiesel： alternative liquid fuels for future generations [J]. Engineering in Life Sciences， 2010， 10（1）： 8-18.

[13]Friso G， Majeran W， Huang M， et al. Reconstruction of metabolic pathways， protein expression， and homeostasis machineries across maize bundle sheath and mesophyll chloroplasts： large-scale quantitative proteomics using the first maize genome assembly [J]. Plant Physiology， 2010， 152（3）：1219-1250.

[14]Dietrich C R， Cui F， Packila M L， et al. Maize Mu transposons are targeted to the 5′ untranslated region of the gl8 gene and sequences flanking Mu target-site duplications exhibit nonrandom nucleotide composition throughout the genome [J]. Genetics， 2002， 160（2）： 697-716.

[15]Nordborg M， Walbot V. Estimating allelic diversity generated by excision of different transposon types [J]. Theoretical and Applied Genetics， 1995， 90（6）： 771-775.

[16]Pooma W， Gersos C， Grotewold E. Transposon insertions in the promoter of the Zea mays a1 gene differentially affect transcription by the Myb factors P and C1 [J]. Genetics， 2002， 161（2）： 793-801.

[17]Fernandes J， Dong Q， Schneider B， et al. Genome-wide mutagenesis of Zea mays L. using RescueMu transposons [J]. Genome Biology， 2004， 5（10）： R82.

[18]Liu S， Dietrich C R， Schnable P S. DLA-based strategies for cloning insertion mutants： cloning the gl4 locus of maize using Mu transposon tagged alleles [J]. Genetics， 2009， 183（4）： 1215-1225.

[19]Liu Y G， Whittier R F. Thermal asymmetric interlaced PCR： automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking [J]. Genomics， 1995， 25（3）： 674-681.

[20]Settles A M， Latshaw S， Mccarty D R. Molecular analysis of high-copy insertion sites in maize [J]. Nucleic Acids Research， 2004， 32（6）： e54.

[21]刘文婷， 高友军， 腾峰， 等. Mutator 轉座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价 [J]. 科学通报 （中文版）， 2006， 51（17）： 2030-2036.

[22]Raizada M N， Nan G L， Walbot V. Somatic and germinal mobility of the RescueMu transposon in transgenic maize [J]. The Plant Cell， 2001， 13（7）： 1587-1608.

[23]Walbot V. Saturation mutagenesis using maize transposons[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2000， 3（2）： 103-107.

[24]张少斌， 张力， 刘慧， 等. 玉米 Mutator 转座子的研究进展 [J]. 贵州农业科学， 2013， 41（6）： 5-7.

[25]Magori S， Citovsky V. Epigenetic control of Agrobacterium T-DNA integration [J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Gene Regulatory Mechanisms， 2011， 1809（8）： 388-394.

[26]Siebert P D， Chenchik A， Kellogg D E， et al. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA [J]. Nucleic Acids Research， 1995， 23（6）： 1087-1088.

[27]Does M P， Dekker B M， De Groot M J， et al. A quick method to estimate the T-DNA copy number in transgenic plants at an early stage after transformation， using inverse PCR [J]. Plant Molecular Biology， 1991， 17（1）： 151-153.

[28]Cruz-Requena M， Aguilar-Gonzlez C， Espinoza-Velazquez J， et al. AFLPs loci associated with polyembryonic maize using selective genotyping analysis [J]. Israel Journal of Plant Sciences， 2013， 61（1/2/3/4）：46-50.

[29]李見坤， 郑军. 玉米Mutator转座子突变体库研究进展[J]. 分子植物育种， 2012， 10（2）： 238-244.

[30]May B P， Liu H， Vollbrecht E， et al. Maize-targeted mutagenesis： a knockout resource for maize [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100（20）： 11541-11546.

[31]McCarty D R， Settles A M， Suzuki M， et al. Steady-state transposon mutagenesis in inbred maize [J]. The Plant Journal， 2005， 44（1）： 52-61.

[32]刘德璞， 袁英， 郝文媛， 等. 农杆菌介导的玉米合子基因转化 [J]. 分子植物育种， 2008， 6（5）： 874-880.

[33]成业， 么大轩， 刘云婷， 等. Mutator 转座子介导的玉米甜质突变体侧翼序列克隆 [J]. 华北农学报， 2016，31（2）： 28-31.

[34]陈果， 李见坤， 王国英， 等. Mu 转座子介导的玉米插入突变体的鉴定 [J]. 分子植物育种， 2011， 9（5）： 572-578.

[35]陈果， 陈勋基， 李建平， 等. 玉米 ZmCIPK23 基因 Mutator 插入突变体的鉴定 [J]. 新疆农业科学， 2017， 54（7）： 1185-1190.

[36]Swanson-Wagner R， Briskine R， Schaefer R， et al. Reshaping of the maize transcriptome by domestication [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2012， 109（29）： 11878-11883.

[37]Schnable P S， Ware D， Fulton R S， et al. The B73 maize genome： complexity， diversity， and dynamics [J]. Science， 2009， 326（5956）： 1112-1115.

[38]Chia J M， Song C， Bradbury P J， et al. Maize HapMap2 identifies extant variation from a genome in flux [J]. Nature Genetics， 2012， 44（7）： 803-807.