山东省鸭类感染猪圆环病毒3型的初步调查

刘玉伟 辛长勋 王硕 高梅 郑书轩 时建立 彭喆 吴晓燕 王金宝 李俊

摘要：2016年，美国学者首次从患有皮炎肾病综合征和繁殖障碍母猪体内检测到一种新发的猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。山东省猪群已检测出PCV3阳性感染，而对于山东省鸭类PCV3的感染情况未有报道。本研究采用PCR检测方法，对山东省鸭场采集的146份样品进行PCV3检测，检出阳性率为零，表明山东省鸭类不存在PCV3感染。

关键词：猪圆环病毒3型；鸭；PCR；山东省

中图分类号：S858.322.65+9.5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0126-03

Abstract In 2016， a new type of porcine circovirus named as Porcine circovirus 3 （PCV3） from sows with dermatitis-nephritic syndrome and reproductive failure was first reported in America. PCV3 has been detected in sows and live-born infants in Shandong Province. However， the infection of PCV3 in ducks has not been reported. In this study， 146 samples were collected from duck farms in Shandong Province. The samples were tested by PCV3 PCR. The results showed zero positive. In conclusion， there was no PCV3 infection in ducks in Shandong Province.

Keywords Porcine circovirus 3； Duck； PCR； Shandong Province

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是单股闭合环状DNA 病毒，粒子直径平均为17 nm，无囊膜，是目前已报道的最小的动物类病毒[1]。猪圆环病毒是圆环病毒属的代表种，根据其致病性、抗原性及核苷酸序列的差异性，将其划分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）。

PCV1不产生细胞病变，不会引起猪的发病[2]。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征[3]，同时还与母猪繁殖障碍[4]、猪皮炎与肾病综合征[5]、猪坏死性及增生性肺炎[6]等疾病密切相关。世界各地规模化猪场普遍存在PCV2感染，给全球养猪业造成的危害不可估计。

2016年，美国学者首次发现并报道了PCV3[7]。目前，山东省猪群已检测出PCV3阳性感染[8，9]。有报道称，中国的犬类也检测出PCV3阳性感染[10]。山东省作为中国的养鸭大省，鸭类是否感染PCV3尚未报道。为了解山东省鸭群PCV3的情况，本研究从山东省6个鸭场随机采集146份样品，采用PCR检测方法进行PCV3检测，以期为山东省鸭类是否受PCV3的威胁提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在山东省的6个鸭场随机采集116份血清和30份组织样品（淋巴结、脾脏、肺脏）。

1.2 主要试剂与仪器

10%十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、Tris饱和酚均购自北京Solarbio公司；无水乙醇、70%乙醇和三氯甲烷均购自国药集团化学试剂有限公司；双蒸水购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DL-2000 DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司；2×Taq PCR StarMix购自上海起发实验试剂有限公司。

组织裂解器购自德国QIAGEN公司；DK-8D型电热恒温水槽购自上海精宏实验设备有限公司；移液枪和台式离心机均购自德国Eppendorf公司；PTC-2000型PCR仪购自美国MJ Research公司；凝胶成像仪购自Alpha Innotech公司。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计 根据 GenBank公布的PCV3 基因序列，在其高度保守区域，利用Primer Premier 5.0软件辅助设计一对特异性引物，扩增片段为330 bp。由生工生物工程（上海）股份有限公司负责合成引物。引物序列见表1。

1.3.2 DNA提取 根据《动物病毒学》[11]，采用SDS-蛋白酶K法提取DNA。

1.3.3 PCR扩增 将提取的DNA进行PCR扩增。扩增反应采用20 μL体系，依次在反应管中加入2×Taq PCR StarMix 10 μL、PCV3-F 1 μL、PCV3-R 1 μL、DNA模板1 μL，最后加雙蒸水至体积为20 μL。同时设立阴性对照和阳性对照。

反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环；最后72℃延伸5 min。PCR反应结束后，取出5 μL产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余产物保存于4℃。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

利用所设计的PCV3引物对阴、阳性样品进行PCR扩增。图1所示， PCV3阳性样品可扩增出1条约330 bp条带，与预期片段大小相符；阴性样品无条带。

2.2 临床样品检测结果

图2为部分样品PCV3检测结果。 146份临床样品均为PCV3阴性，阳性率为零。由于本次调查仅选取山东省内6个鸭场且在冬季进行检测，气温较低且稳定，使得鸭群疾病发生率较低，所以调查结果可能存在一定的片面性与局限性，更加全面有效的PCV3感染情况有待于进一步的调查研究。

3 讨论与结论

自2016年美国首次发现并报道PCV3以来，中国等国家猪群相继检测出PCV3阳性感染，给全球养猪业造成的损失不容忽视。随着中国犬类感染PCV3的报道，PCV3的阳性感染与防控得到越来越多的关注与重视。目前，对于PCV3的研究还处于初级阶段，市场严重缺乏针对性的疫苗和药物。鉴于PCV3存在传播速度快、途径多、范围广的特征，今后在饲养过程中需要更加重视PCV3的研究和监控工作。首先，猪场需要加强生物安全体系，提高饲养管理水平，增强猪群免疫力，切断病毒和有害细菌传播途径；其次，加快开展相关检测技术的研究，建立PCV3快速、灵敏、特异的血清学检测方法及相关检测技术，如利用胶体金免疫层析技术制备PCV3抗原检测试纸条等，对出入口岸农畜产品进行PCV3快速筛查；最后，分离与鉴定 PCV3毒株，进而开展疫苗研发与动物回归试验，为我国养殖业的健康发展保駕护航。

山东省鸭类养殖规模较大，目前尚无山东省鸭群存在PCV3阳性感染的报道。本次调查没有检测出山东省鸭类PCV3的阳性感染，初步表明，目前山东省鸭类不存在PCV3感染，说明PCV3对山东省鸭群暂时没有造成威胁。推测PCV3主要在哺乳动物体内引起感染，鸟类不会感染此病毒。

参 考 文 献：

[1] Tischer I， Gelderblom H， Vettermann W， et al. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J]. Nature， 1982， 295（5488）：64-66.

[2] Tischer I， Mields W， Wolff D， et al. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus[J]. Arch. Virol.， 1986， 91（3/4）： 271-276.

[3] Baekbo P， Kristensen C S， Larsen L E. Porcine circovirus diseases： a review of PMWS[J]. Transbound Emerg. Dis.， 2012， 59（S1）： 60-67.

[4] Karuppannan A K， Ramesh A， Reddy Y K， et al. Emergence of porcine circovirus 2 associated reproductive failure in Southern India[J]. Transbound Emerg. Dis.，2016， 63（3）： 314-320.

[5] Allan G M， McNeilly E， Kennedy S， et al. PCV-2-associated PDNS in Northern Ireland in 1990. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome[J]. Vet. Rec.， 2000， 146（24）：711-712.

[6] Szeredi L， Szentirmai C. Proliferative and necrotising pneumonia and severe vascular lesions in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2[J]. Acta Vet. Hung.， 2008， 56（1）： 101-109.

[7] Pallnski R， Pieyro P， Shang P， et al. A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J]. J. Virol.， 2016， 91（1）： e01879-16.

[8] 刘晓东，杨旭兵，郑庆礼，等. 我国部分省（区）猪圆环病毒3型的分子流行病学研究[J]. 动物医学进展， 2017，38（11）：18-21.

[9] Zheng S X， Wu X Y， Zhang L L， et al. The occurrence of porcine circovirus 3 without clinical infection signs in Shandong Province[J]. Transbound Emerg. Dis.， 2017， 64（5）：1337-1341.

[10]Zhang J X， Liu Z G， Zou Y W， et al. First molecular detection of porcine circovirus type 3 in dogs in China[J]. Virus Genes，2018，54（1）：140-144.

[11]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京： 科学出版社， 1997： 681-688.