高通量分子标记技术辅助回交选育高油酸花生新种质

徐平丽 唐桂英 付春 柳展基 鲁成凯 姜言生 单雷

摘要：以山东大花生鲁花14号（LH14）为母本、高油酸花生开农176（KN176）为父本配置杂交组合，再以LH14为轮回亲本历经4次回交获得BC4F1，期间用TaqMan探针标记技术辅助杂种AhFAD2B基因型选择；BC4F1经连续自交、田间筛选并辅助KASP分子标记鉴别后代籽粒AhFAD2B基因的基因型，獲得基因型aabb的BC4F5株系10个，它们分别来源于BC4F1代7个单株。分析这10个株系产量及品质性状，结果显示各株系结果集中，单株平均荚果数、果型与母本LH14相似，油酸含量为68.67%～77.93%；其中7个株系的百果重、饱果率和6个株系的百仁重分别比对照LH14提高0.02%～16.05%、4.55%～12.31%和0.05%～9.41%。综合各株系田间表现及籽粒品质指标，最终选择油酸含量高于70%的7个BC4F5代株系进行DUS测试、品种区试和生产试验。TaqMan探针标记与KASP标记结合应用于高油酸品种选育过程中，大大减少了田间选择的工作量，提高了回交选育高油酸花生的效率。

关键词：花生；高油酸；回交；分子标记辅助选育

中图分类号：S565.203.5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0046-07

Abstract The cross combination， Luhua 14 （LH14） ×Kainong 176 （KN176）， was made using large-seeded peanut cultivar LH14 as female parent and KN176 with high oleic acid content as male parent. Furthermore， using LH14 as recurrent parent，BC4F1 generation was obtained by successive backcrosses for 4 times. The AhFAD2B genotype single plant from each generation （including F1 and BC1F1-BC4F1） was determined by TaqMan probe method. Ten lines of BC4F5 generation derived from 7 single plants of BC4F1 were obtained by continuous self-crossing through screening in field by agronomic traits combined with genotype identification of AhFAD2B gene by high-throughput KASP molecular marker. These 10 BC4F5 lines with aabb genotype were evaluated in yield and quality traits. The results showed that the average pod number and pod shape of each line were similar to those of maternal LH14， and the oleic acid content of different lines arranged from 68.67% to 77.93%. Compared with LH14， the weight of hundred pods and percent of plump pods per plant in 7 lines， and the hundred-kernel weight in 6 lines increased by 0.02%～16.05%，4.55%～12.31 % and 0.05%～9.41%， respectively. According to overall performance of agronomic characters and kernel quality， 7 BC4F5 lines with oleic acid content above 70% were chosen for DUS test， variety regional trail and production test. The effective application of TaqMan probe method and high-throughput KASP technology in high-oleic peanut breeding greatly reduced the workload of selection in field and improved the breeding efficiency.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）； High oleic acid； Backcross； Molecular marker assisted selection

花生是我国重要的经济作物和油料作物。花生籽粒脂肪酸的组成是衡量花生品质的重要指标。油酸、亚油酸是花生籽粒脂肪酸的主要成分，含量分别占其总脂肪酸含量的36.1%～67.0%、13.0%～43.0%；此外还包括硬脂酸1.3%～6.5%、软脂酸6.0%～11.5%和亚麻酸（<0.1%）等[1]。油酸含有单不饱和键，相比亚油酸、亚麻酸等多不饱和脂肪酸更稳定，提高油酸含量可以改善花生及花生制品的口味和氧化稳定性，因此，高油酸花生作为一种优质的油脂来源，越来越受到消费者的青睐[2，3]。

我国高油酸花生育种研究起步较晚、育成的品种比较少，且大多来源于美国突变体F435及其衍生系。F435的油酸含量80%，亚油酸仅占2%，其油酸性状由两对非等位基因AhFAD2A和AhFAD2B控制，AhFAD2A基因448nt处G→A碱基的替代以及AhFAD2B基因442nt处A碱基的插入，导致了高油酸性状的产生[4-8]。针对这两个位点，近年来研究者开发了多种类型的分子标记，如限制性酶切扩增多态性（CAPS，cleaved amplified polymorphic sequence）、等位基因特异PCR（AS-PCR，allele-specific PCR）、TaqMan探针标记及KASP（kompetitive allele specific PCR）标记等。这些标记已被用于鉴别AhFAD2A和AhFAD2B基因的等位差异，并开始应用于高油酸花生育种过程[9-12]。

为了选育适应山东及北方大花生产区的高油酸花生新品种，我们以山东大花生品种鲁花14号为母本及轮回亲本、高油酸花生KN176为父本，将TaqMan探针标记及KASP标记检测手段辅助应用在整个回交、自交选育过程中，有效缩短了花生高油酸的选育进程，并选育出一系列油酸含量高于70%的花生新品系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 亲本材料 母本鲁花14号（LH14），O/L比值1.70，山东省花生研究所提供。父本开农176（KN176），O/L比值11.13，开封市农业科学院育成的高油酸花生品种，种子由河南省农业科学院经济作物研究所黄冰艳研究员提供。

1.1.2 试剂 植物基因组DNA提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司（TIANGEN，中国北京）产品；荧光定量PCR使用大连TaKaRa生物技术公司（TaKaRa，中国大连）产品Premix Ex Taq（probe qPCR）；KASP Master mix为LGC公司（英国）产品。

1.1.3 引物和探针 用于荧光定量的引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司（中国上海）合成，KASP检测引物由英国LGC公司（英国）合成。花生杂交、回交选育过程中TaqMan qPCR检测引物和探针序列、KASP检测的引物序列参见徐平丽等（2016）报道[11]。

1.2 方法

1.2.1 选育过程 2013年春，播种亲本LH14和KN176种子于杂交池中，盛花期开始杂交，秋季收获F1代杂交种子，TaqMan探针法检测F1代种子AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型，筛选获得真杂种。KN176 AhFAD2A和AhFAD2B基因型分别为aa和bb， LH14 AhFAD2A和AhFAD2B基因型为aa和BB[13]，两个亲本的AhFAD2A均已突变为aa，因此，F1真杂种 AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型为aaBb，后代检测只针对AhFAD2B基因型即可。同年冬季于海南加代回交，LH14作轮回亲本，F1代基因型aaBb杂交种作父本，回交获得BC1F1种子，TaqMan探针法筛选基因型aaBb的BC1F1真杂种，用作进一步的回交父本。2014年春、冬两季和2015年春季，继续与轮回亲本回交、TaqMan探针法筛选基因型aaBb真杂种。2015年秋收获BC4F1种子，同年冬季于海南自交加代，2016年春收获BC4F2代种子，播种于济南饮马泉试验基地进行单株选择，KASP法辅助检测它们的基因型；秋季单株收获基因型为 aabb和aaBb的BC4F3代种子。2016年冬及2017年春和冬，株行种植基因型 aabb的选留单株，BC4F4、BC4F5代选择与LH14田间农艺性状基本相似株系，并用近红外反射光谱法对油酸含量进行辅助选择（图1）。

1.2.2 花生种子和叶片DNA提取 手术刀切取花生种子远离胚根端约0.4 mm厚的子叶组织薄片，或取田间新鲜幼嫩花生叶片约1 g，放入1.5 mL Eppendorf管中，按照TIANGEN公司植物基因组DNA提取试剂盒提供的方法提取花生种子或叶片基因组DNA，溶解于适量无菌去离子水中。分光光度计和凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，并稀释至合适的浓度备用。

1.2.3 TaqMan探针标记检测AhFAD2B基因型 以基因组DNA为模板，针对AhFAD2B 442位A/- InDel的扩增引物对为qFAD2B-F和qFAD2B-R，区分野生型位点和突变体位点A碱基插入的荧光探针為qFAD2B-p0和qFAD2B-pA442，在ABI7500实时荧光PCR仪（美国应用生物系统公司）上按照基因分型实验流程操作进行。引物序列信息及PCR反应体系、实验程序按照徐平丽等（2016）的方法进行[11]。

1.2.4 KASP高通量检测AhFAD2B基因型 以基因组DNA为模板，针对AhFAD2B 442位A/- InDel的正向引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI，反向引物kFAD2B-R；引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI的5′端分别与加尾序列Allele-1 tail和Allele-2 tail相连，等位差异设计在引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI的3′端。通用引物（与加尾序列相同）的5′端分别标记FAM和HEX荧光。根据收集荧光的不同，确定基因分型。引物信息及KASP反应体系、实验程序等按照徐平丽等（2016）的方法进行[11]。

1.2.5 回交后代材料的田间选择 从BC4F2代开始，对自交群体单株进行苗期田间调查，记录其出苗、苗期生长、开花、结果及抗病性等情况，选择综合性状良好，特别是株型直立、结果集中、饱果率高、果型好的单株继续传代进行筛选，并辅助基因型筛选；BC4F4代执行株行选择，对基因型为aabb的株行田间表现进行调查，选择整齐一致且收获期表现良好的株行作为进一步扩繁的材料；BC4F5则选取重要农艺性状相似于母本材料LH14的优良株行，每个同一来源的株行作为一个株系；基因型为aaBb的优良单株作为备选单株，留作后续基因型隐性纯合后进一步田间筛选。

1.2.6 BC4F5代材料高油酸株系产量及品质分析 收获时统计基因型aabb的BC4F5材料的单株荚果数、饱果率、株型、株高、分枝数等性状，计算各株系的百果重、百仁重等重要产量指标。BC4F5各株系的各项农艺性状和产量性状以轮回亲本LH14为对照进行比较。

利用波通仪器公司的DA7250型近红外分析仪，通过近红外反射光谱（near infrared reflectance spectroscopy，NIRs），初步分析籽粒的油酸、亚油酸含量、蛋白质含量和含油量等品质指标，设3个生物学重复，统计结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 TaqMan探针鉴定F1代及回交各世代花生种子基因型

由于配制组合选用的高油酸亲本KN176基因型为aabb，母本材料LH14的基因型为aaBB[13]，因此，基因型aaBb的F1代即为真杂种。为进一步改良母本的油酸性状，后续回交世代选取基因型aaBb的F1、BC1F1、BC2F1、BC3F1代真杂种依次作回交父本，最终通过一次杂交、四次回交获得BC4F1代。

F1、BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1世代材料样本量不大，利用TaqMan探针法筛选基因型为aaBb的这些世代真杂种单株材料。受杂交池和海南加代条件等限制，以及杂交技术的影响，尽管我们杂交了大量的花，但获得的真杂种数量较少，特别是F1代（表1）。不过，由于TaqMan探针法能保证检测的准确率（>95%），因此这些杂种作为回交父本可满足回交要求。

2.2 KASP技术鉴定BC4F2及其它自交后代单株的基因型

将基因型为aaBb的BC4F1种子播种在试验田，结合单株结果数、饱果数、果型、株型、叶型等田间综合性状，终选10个单株收获BC4F2自交后代种子。通过基因型鉴定，aabb和aaBb的BC4F2单株继续种植，并结合田间综合表现进行筛选，共获得25个BC4F3单株（5个aabb，20个aaBb），它们来源于8个BC4F1系。基因型鉴别为aabb的5个单株收获的BC4F4种子株行种植，进一步选择综合性状表现优良的BC4F5；同时基因型为aaBb单株收获的种子继续基因型鉴别和单株选择，最终筛选获得来源于7个BC4F1株、基因型为aabb且综合性状良好的BC4F5代株系10个，并分别编号（世代-粒编号-株系）。利用KASP标记检测种子基因型（上代基因型aabb的后代种子不再分型检测），检出率高于93.49%，有效保证了选育高油酸性状的准确性和效率，部分分型结果见表2。

2.3 花生高油酸株系的获得及BC4F5代材料的产量性状分析

经过BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1各回交后代基因型检测及BC4F2、BC4F3代自交群体田间单株选择、BC4F4株行选择并辅助基因型选择，筛选获得来源于BC4F2的7个单株基因型为aabb的BC4F5 10个株系。调查BC4F5代10个株系的各株行田间表现发现，选育的各株系株型直立紧凑、结果集中，4个株系的主茎高为38～45 cm、1个株系高于65 cm、其余株系主茎高在45～65 cm之间，分枝数8～12个，果型与母本LH14相似（图2，表3）。与对照LH14相比，大多数株系平均百果重、百仁重和饱果率好于对照。其中7个株系平均百果重为172.41～200.04 g，與对照相比，提高幅度为0.02%～16.05%，平均提高（4.98±5.65）%；7个株系的平均饱果率为76.71%～82.41%，提高幅度4.55%～12.31 %，平均提高（8.16±2.80）%；6个株系平均百仁重为73.25～80.10 g，提高幅度为0.05%～9.41%，平均提高（4.81±3.34）%。选出株系单株平均荚果数为16.44～19.65个，与LH14相比没有明显差异（表4）。各株系之间以及与对照亲本之间，单株平均荚果数差异不显著，平均百果重、平均百仁重、平均饱果率差异显著，不同株系之间的表现略有不同，这些将作为终选株系的重要参考指标。

2.4 BC4F5高油酸株系籽粒品质性状分析

采用近红外反射光谱法初步分析了BC4F5部分株系（30～50粒/株系）籽粒油酸、亚油酸、蛋白质含量及含油量等品质指标，发现基因型为aabb的BC4F5代10个株系，油酸含量在68.67%～77.93%之间，平均为（74.09±3.37）%，大部分选留株系的油酸含量已达70%以上（表5）。最终，综合考虑株型、株高、饱果率、百果重及近红外光谱初步测定的品质指标，选择7个BC4F5代优良株系作为后续品种比较的材料。其中BC4F5-143-1、BC4F5-145-4、BC4F5-199-8、BC4F5-202-10油酸含量高于75%，BC4F5-144-1、BC4F5-170-6、BC4F5-198-8油酸含量高于73%。株系BC4F5-172-7、BC4F5-176-7油酸含量在68%～69%之间，低于预期，并且它们的株高较高，百果重、饱果率都较低，因此被淘汰。虽然BC4F5-162-5油酸含量也达到73%，但因其株高等因素落选。此外，由于蛋白质、含油量对花生种子的风味和营养价值的影响，后续的研究中也是我们进一步关注的性状 。

3 讨论

截止2016年底，我国共育成38个高油酸花生品种，18个大粒品种，20个小粒品种[2]，高油酸品种相对较少。这些品种主要是通过双亲杂交后系谱法选育的，控制高油酸性状的基因来源于美国高油酸品种F435及其衍生系。回交选育作为创制优质花生种质资源手段之一，可以通过多轮次回交将某个优良性状定向转移到现有推广的优良品种中，同时保留该品种的其它优良特性。

鲁花14号属于比较适应北方花生产区的大花生，株型直立紧凑，蛋白质含量23.6%，粗脂肪含量52.12%，普通油酸含量48.5%，油亚比1.70，抗旱、较抗多种叶部病害和条纹病毒病，品种适应性广。父本开农176是我国第一个通过国家鉴定的高油酸花生，油酸含量76.8%，油亚比11.13，与美国F435来源的高油酸突变体基因型相同，控制油酸性状的两个基因AhFAD2A/AhFAD2B均已突变。我们期望通过多次回交将开农176的高油酸性状导入鲁花14号，获得既具备开农176的高油酸性状又保留了轮回亲本鲁花14号优良性状的高油酸新材料。作物回交育种实践表明，作物性状遗传改良通过4～6次回交，多数可以达到预期效果[14]。理论上，通过1次杂交、4次回交，回交后代已具备轮回亲本高于96%的性状，后代已逐步接近轮回亲本。选育过程中辅助分子标记技术对与油酸相关的基因型进行筛选，大大减少了后期田间筛选的工作量，显著提高了育种效率。再者，冬季在海南种子的加代工作，也有效缩短了高油酸花生的选种进程[11]。