西番莲组织培养技术研究

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(1.西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室， 云南 昆明 650224；2.西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室， 昆明 650224)

西番莲(PassifloraedulisSims)又称百香果、鸡蛋果、热情之果，原产南美洲的巴西至阿根廷一带，广泛分布于热带、亚热带地区[1]，是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(PassifloraL.)的多年生常绿藤本植物，有“果汁之王”的美誉。西番莲集果用、药用、油用和绿化观赏为一体，经济价值非常高。它的果实中富含类胡萝卜素、还原糖、多种维生素、蛋白质、人体所需的17种氨基酸及大量微量元素等，具有消除疲劳、美容养颜、抑菌抗癌及降低胆固醇等多种保健疗效[2-4]，可作水果鲜食。另外，因果汁风味独特，口感香甜，素有“果汁之王”的美誉，所以果实多用于加工成饮料及口服液等[5]。近年来世界各地对西番莲果汁需求日益增多，西番莲生产规模不断扩大，生产发展迅速[6]。我国种植业起步相对较晚，西番莲扩繁主要采用实生苗与蔓条扦插繁殖[7]，生产中存在较多问题，如实生苗的培育种子萌发率与成活率低，缓苗期长、抗病性低等问题；蔓条扦插繁殖若操作不当会加快品种退化、病害增加致使产量降低，这些问题影响和制约了西番莲的加工与生产[8-11]。鉴于此，国内外开展了西番莲组织离体再生研究，并且已经取得了一定的进展。通过西番莲组织培养研究不仅可以进行优良品种筛选，解决品种单一的问题，还可扩大种质资源，并加以保护和利用。在离体器官培养方面，进行了茎尖、茎段、子叶、下胚轴、卷须、花粉、原生质体[12-15]的培养研究，都获得了成功，建立了高效再生体系。但是，国内外对西番莲组织培养的研究较少，其离体快繁体系也不完善。为此，建立一个快速高效的离体再生系统日显重要。胚乳是天然的三倍体组织，早在20世纪30年代，科学家们就开展了胚乳培养研究，由胚乳培养获得三倍体再生植株，就有可能因此建立起三倍体新类型，产生无籽果实，从生产的角度看，无籽果实较受欢迎，人们对胚乳培养一直较为青睐[16-18]。因此，果树胚乳培养不仅具有理论价值，而且有应用前景。本试验以茎段、胚乳作外植体，利用西番莲植株的茎段进行腋芽与愈伤诱导，同期进行胚乳的愈伤诱导，对西番莲的快繁体技术进行研究，以期为今后西番莲的选育及综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的西番莲外植体灭菌材料均取自西南林业大学内苗圃。选取当年新抽、无病虫为害、生长健壮的嫩枝9～10个节。

在选取的外植体灭菌试验材料中，以带节茎段作为无菌芽诱导的材料，以无节茎段与胚乳作为愈伤组织诱导的材料。

1.2 方 法

将取回的嫩枝用自来水冲洗干净，然后用流水冲洗30 min，将冲洗好的材料置于超净工作台上。用浓硫酸浸泡西番莲种子至即将破裂为止。将处理过的西番莲带壳种子与冲洗好的茎段先用70%酒精消毒30 s，然后用0.1%升汞(HgCl2)灭菌8 min。灭菌过程中要不断地摇晃灭菌瓶，保证灭菌剂全面浸透外植体，灭菌完毕后用无菌水冲洗外植体3～5次，每次间隔1～2 min，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。

1.3 接种培养基

茎段培养中将茎段切成长约8 mm的带芽或无芽茎段培养。胚乳培养需在超净台上将种子纵剖为两半，剥去种壳，取出胚乳后一半剔除胚，一半保留胚，将带胚胚乳与不带胚胚乳分开接种到诱导愈伤组织的培养基上培养。西番莲外植体芽的诱导、愈伤组织的诱导及分化、芽的继代增殖均以MS为基本培养基，附加细胞分裂素6-BA和生长素NAA、IBA。在1.41 kg/cm2的饱和蒸汽条件下灭菌21 mm。不同浓度的6-BA和NAA、IBA配合组成培养基系列(表1)和不同浓度的蔗糖，0.7%琼脂，pH值5.8～6.0。培养条件：培养温度为(25±2)℃，光照强度1 500～1 800 lx、置于光照时间12 h的培养室中置架培养。

表1 茎段培养的培养基配方

处理号培养基配方J1MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAAJ2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBAJ3MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LIBAJ4MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LIAA

表2 胚乳诱导愈伤组织的培养基配方

处理号培养基配方P1MS+1.0mg/L6-BA+0.025mg/LNAAP2MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAAP3MS+1.0mg/L6-BA+0.075mg/LNAAP4MS+1.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA

1.4 生理指标测定

完成外植体灭菌接种工作后，随时对培养过程中外植体的颜色和形态变化进行观察和记录；第10天统计不同处理的污染情况并计算污染率；第20天统计无节茎段等外植体的出愈情况，计算诱导率；第30天统计不同处理的芽诱导情况、苗的生长状况等，计算出芽诱导率；并观察苗的长势，有关统计指标如下。

菌污染率(%)=菌污染的外植体数/接种的外植体总数×100%；

芽诱导率(%)=诱导出不定芽的外植体数/接种外植体总数×100%；

诱导率(%)=诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%；

死亡率(%)=死亡的外植体数/接种外植体总数×100%。

1.5 数据分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析；用Excel 2003软件进行图表分析。

表3 不同培养基配方对茎段培养的影响

处理号接种数(个)菌污染率(%)死亡率(%)诱导率(%)芽诱导率(%)颜色与大小质地J11833.3316.6733.3327.78浅绿色,质地较密实,愈伤组织较小,腋芽较小呈翠绿色J21822.2216.6727.7844.44浅绿色,质地较松软,愈伤组织中等,腋芽中等呈翠绿色J31816.6711.1166.6744.44浅绿色,质地较松软,愈伤组织较大,腋芽较大呈翠绿色J41822.2222.2255.5655.56浅绿色,质地较密实,愈伤组织中等,腋芽较大呈嫩绿色

表4 不同培养基配方对胚乳愈伤组织诱导的影响

处理号接种数(个)菌污染率(%)死亡率(%)诱导率(%)芽诱导率(%)颜色与大小质地P112046.6700均无愈伤组织,部分有褐化现象P21202516.6716.67带胚胚乳:翠绿色,质地较松软,愈伤组织较大,不定芽丛生,部分也出现有褐化现象无胚胚乳:无愈伤组织,部分有褐化现象P31205000均无愈伤组织,部分有褐化现象P412046.6700均无愈伤组织,部分有褐化现象

2 结果与分析

2.1 不同培养基配方对茎段培养的影响

茎段培养的外植体接种1周左右开始膨大，形态学上端较形态学下端先产生愈伤组织。带节的茎段在茎节处极易出芽，无节茎段在切口处形成绿色、瘤状愈伤组织，经一段时间培养后从愈伤组织上形成绿色芽点而后丛生出多个细长的不定芽，成熟植株带芽茎段经培养能够诱导腋芽生长获得无性系材料。由表3可知，J 3、J 4诱导率与芽诱导率达最高。

J 3的诱导率与芽诱导率分别为66.67%与55.56%，J 4的诱导率与芽诱导率分别为55.56%与44.44%，J 3略高于J 4，茎段在MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA上，分化率达到最高。J 3配方芽生长正常，快速，畸形苗少(图1)。且J 3的死亡率在4个培养基配方里最小。

2.2 不同培养基配方对胚乳愈伤组织诱导的影响

由表4可看出，仅有P 2(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA)组合中带胚胚乳在胚与胚乳间有愈伤组织产生，愈伤组织呈翠绿色，面积较大，质地松软，其它组合培养基中的胚乳无变化或由刚接入的嫩白色渐渐褐化死亡。

在胚乳诱导出愈伤组织后，将胚从胚乳中剥离出来，观察发现，愈伤组织与不定芽都由胚乳诱导出，胚可以轻易地剥离，上面也并未有愈伤组织产生。P 2培养基诱导产生的愈伤组织体积较大，颜色为嫩绿色，质地疏松并有不定芽产生(图2)。因此，从诱导率、芽诱导率、质地及是否便于操作等方面综合考虑，认为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培养基在试验条件下最适宜诱导西番莲胚乳愈伤组织。

图1 1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IBA培养基的茎段培养

图2 1.0 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA培养基诱导的胚乳愈伤组织

3 讨 论

近些年来，植株的胚乳培养引起了众多研究者的注意，因培养胚乳和胚乳植株产生无籽果实用于经济作物上有很高的利用价值，并有可能为育种工作提供三倍体和多倍体的育种方法和原始材料。以往三倍体育种的常规方法是先诱导四倍体植株，待其开花后再与二倍体品种杂交[19]，不仅需时长，三倍体的获得率也很低，仅占10%[4]，出现的植株多为非整倍体植株及遗传性状不良的个体。因此通过胚乳培养获得三倍体植株改良品种，是育种工作中的一条新途径，在理论和实践上具有重大意义。由于胚乳的生理活性十分微弱，所以胚乳的愈伤组织诱导比较困难，有关西番莲胚乳培养的报道较少，仅张琴等[15]在2000年进行过西番莲胚乳培养。

本试验对已有的西番莲组织培养进行研究，利用茎段与胚乳进行培养。由于西番莲种子种壳较厚，表面有角质化外壳，接种时不易剖开，试验中利用浓硫酸浸泡使其种壳变薄，既解决了不带壳消毒损伤种子的问题，又解决了种壳过硬不易剖开的问题。利用西番莲嫩茎进行腋芽与愈伤组织诱导，在已有西番莲茎段愈伤组织诱导研究的基础上挑选效果较好的4个配方进行对比，在茎段培养的4个配方中均有愈伤组织产生，MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA培养基中，愈伤组织产生率是最高的，达到66.67%，愈伤组织质地松软，颜色翠绿。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IAA中愈伤组织产生率为55.56%，芽诱导率为55.56%，说明配方MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA有利于愈伤组织的形成，而MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IAA则有利于有节茎段的腋芽发育。

在对胚乳愈伤组织诱导时，只有MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培养基中有愈伤组织产生，表明愈伤组织的产生并不随激素浓度的增高而增多，只有适宜的激素浓度才有利于愈伤组织的诱导。生长素和细胞分裂素作为植物生长调节剂，两者的配比是诱导愈伤组织形成极为重要的因素。西番莲茎段与胚乳的愈伤组织诱导中所需要添加的激素为6-BA和IBA、NAA，诱导率为66.67%与16.67%。植株部位不同，激素含量不同，愈伤组织诱导时所需激素配方也不相同。观察诱导出愈伤组织的胚乳，都为带有胚的胚乳。通常带胚比不带胚的胚乳更容易形成愈伤组织，尤其是用干种子的胚乳培养时，由于胚乳的生理活性十分微弱，在诱导其脱分化前，必须借助原位胚的萌发使其活化[20]，这与试验结果一致。本试验通过对西番莲茎段培养及胚乳愈伤组织诱导进行了一些基础研究，希望为进一步研究西番莲离体再生提供参考。