量子点与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究

袁旺秋

【摘 要】生物体内包含大量蛋白质，是人体中最重要的组成部分，它是生命活动的物质基础，在体内有着极其重要的作用，通常需要依靠探针试剂对蛋白质进行研究。半导体量子点有荧光产率高、荧光发射光谱带窄、荧光峰对称、激发光谱分布连续、荧光发射波长可控等特点，这些是一般荧光探针材料不具备的。因此，量子点已经被广泛的作为荧光探针工具。本文主要研究氨基化量子点与羧基化量子点在不同的pH值（pH=2.2、7.4、9.0）与不同温度（27℃、37℃、47℃）环境下与牛血清白蛋白的相互作用机制。

【关键词】牛血清白蛋白；氨基化量子点；羧基化量子点；光谱分析

量子点与牛血清白蛋白的相互作用一直是国内外的研究焦点，但是对量子点与牛血清白蛋白相互作用的报道甚少，有待进一步研究。本文主要利用荧光法研究量子点同牛血清白蛋白间的相互作用，测得牛血清白蛋白与氨基化量子点和羧基化量子点相互作用的荧光光谱，然后根据结果分析得到两种量子点在不同pH值和不同温度环境下相互间发生反应的荧光猝灭类型（动态淬灭或者静态淬灭）、结合位点数n、结合常数K及作用力类型（范德华力、疏水作用力、静电作用力和氢键）、用同步荧光法判定白蛋白的构象变化情况等。再根据这些结果深入了解它们在提取、制备、应用和保存方面的要求。

一、荧光淬灭机理

量子点与牛血清白蛋白的相互作用导致的荧光猝灭类型按照Stern-Volmer方程计算，可以把淬灭类型分为动态猝灭与静态猝灭。这两种淬灭类型有不同的作用，动态猝灭不会导致白蛋白的生理活性与其结构发生变化，因为它只是一种能量或者转移电子转移的过程；静态猝灭则会影响蛋白质的二级结构，而且其生理活性也有可能受影响。因为反应过程中产生了配合反应，并生成不发荧光的配合物。荧光猝灭类型判定方法可以总结为：通过荧光随温度的变化情况以及荧光寿命进行判断，对于动态猝灭，高温会导致体系中的分子运动速度变快，碰撞增加，从而使得动态猝灭常数增大；对于静态猝灭，较高的温度会使得配合物分解，使静态猝灭常数降低。荧光猝灭数据绘制为量子点浓度与牛血清白蛋白的相对荧光强度间的关系，量子点导致的牛血清白蛋白的荧光强度猝灭可以由知名Stern-Volmer方程描述：

二、主要仪器、设备和试剂

1.主要仪器和设备

1）微量移液器；2）电子天平，杭州衡准检测仪器有限公司；3）F-4600荧光分光光度计，日立；4）电脑一台（含测荧光强度软件）；5）50mL、100mL、500mL容量瓶若干，5mL试剂瓶若干、50ml、100ml、200ml定容器若干，棉签若干；6）4ml石英比色皿1个；7）冰箱一台；8）集热式恒温水浴加热器。

2.主要试剂

1）羧基化量子点，氨基化量子点，通过商业途径获得；2）牛血清白蛋白（BSA），MW：66KDa；3）三羟甲基氨基甲烷（Tris），AR，阿拉丁公司；4）甘氨酸，AR，成都市科龙化工试剂厂；5）浓盐酸（浓度36%），无水乙醇（AR），重庆川东化工（集团）有限公司；6）实验中用水均为二次去离子水。

三、量子点与牛血清白蛋白反应的实验步骤

准备10支比色皿，各取3ml 牛血清白蛋白溶液加入10支比色皿中，然后依次加入0～900μL的量子点，最后用pH缓冲液定容为4ml。利用集热式恒温加热水浴加热之后利用荧光分光光度计以波长365nm的激发波长测量其荧光光谱。实验时要求的牛血清白蛋白浓度为1.0×10mol/L，所以分别用不同pH值的缓冲液稀释浓度为2×10mol/L的牛血清白蛋白，将牛血清白蛋白溶液稀释50倍，即1ml定容成50ml。取10个容量为5ml的小试管放在试管架中，利用容积可调的微量移液计往十个小试管中加入3ml的浓度为1.0×10mol/L的牛血清白蛋白溶液，再加入不等量的量子点（从0到1ml，步长为100μl），然后就可以加入与稀释时相对应pH值的缓冲液进行定容至4ml。为了能够检测出量子点对牛血清白蛋白的荧光程度是否有影响，检测量子点与牛血清白蛋白是否发生了反应或者相互作用，第一组试管中溶液为纯牛血清白蛋白溶液，是以对照组的身份出现的。配置完成之后，打开集热式恒温水浴加热器，将温度调节为27℃，当温度达到27℃时将带有10个小试管的试管架放入（注意不可直接将小试管放入）。在集热式恒温水浴加热器中加热60分钟，加热后取出摇晃一段时间使之充分摇匀，之后利用F-4600荧光分光光度计在激发波长ex=365nm的情况下测量量子点和牛血清白蛋白的荧光光谱图（pH=9.0与pH=7.4激发与发射狭缝都是5nm，pH=2.2激发与发射狭缝是10nm）

注意：必须将小试管中的溶液倒入4ml石英比色皿，比色皿必须用无水乙醇来清洗。

四、实验结果分析

这个课题运用了荧光光谱法，在分子层次上研究不同的pH值和不同温度环境下，氨基化量子点和羧基化量子点与牛血清白蛋白之间的相互作用机制，得到以下结论：

1）氨基化量子点与羧基化量子点对牛血清白蛋白的荧光光谱都有淬灭的作用，而且量子点浓度越高，量子点对于牛血清白蛋白的淬灭作用越大。

2）氨基化量子点与羧基化量子点两种物质，分别在三种不同的pH值（pH=2.2、pH=7.4、pH=9.0）和三种不同温度（27℃、37℃、47℃）环境下跟牛血清白蛋白相互作用，当温度逐渐升高时，量子点对牛血清白蛋白的淬灭作用逐渐降低，两种量子点和牛血清白蛋白之间的反应是单一的静态淬灭类型，反应后形成了1：1的配合物。

3）同一pH环境下，温度由27℃→37℃→47℃，氨基化量子点与羧基化量子点对牛血清白蛋白的猝灭强度逐渐減弱；在相同温度环境， PH值逐渐增加的情况下，氨基化量子点与羧基化量子点对于牛血清白蛋白的淬灭作用逐渐增大。

4） 氨基化量子点与羧基化量子点在不同的pH值和不同温度环境下与牛血清白蛋白之间的结合位点数接近1，这说明了氨基化量子点与羧基化量子点同牛血清白蛋白具有一个结合位点，量子点和牛血清白蛋白以1：1的比例从而结合成一种配合物，所以氨基化量子点与羧基化量子点同牛血清白蛋白间具有相对强的结合作用力。

5）当pH=7.4时，氨基化量子点与羧基化量子点和牛血清白蛋白之间的作用力为静电作用力和疏水作用力；当pH=9.0的时候，氨基化量子点与羧基化量子点间的作用力为范德华力，当pH=2.2时，氨基化量子点与羧基化量子点和牛血清白蛋白之间为范德华力与氢键。

【参考文献】

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[3]王腾，何晓囡，张志红，等.光谱法研究阿奇霉素与人血清白蛋白的相互作用[J].北京石油化工学院学报，2011.19（3）：54-59