一种稳定的门冬胰岛素结晶制备方法的研究

张璐

【摘要】目的：对稳定门冬胰岛素结晶制备方法进行研究，并对生产工艺进行优化，以进一步提高门冬胰岛素的稳定性。方法：在室温条件下经过有机酸对比，对于其他胰岛素结晶与有机溶剂中必须添加物质的选择等方式，经过对比实验与优化要求晶型具有稳定均一性。结果：根据本次试验结果表明，有机酸适宜采用浓度为0.5M-1.5M之间的甘氨酸，乙腈、苯酚及氯化钠溶液采取体积分数12%-18%、0.2%-0.3%、0.2M-0.3M，同时还包括含量为门冬胰岛素制备液蛋白浓度稀释至2.0-5.0g·L^-1重组门冬胰岛素。在条件为pH在6.0-6.5环境下加入醋酸锌组成的结晶液，经过放大验证能够得到的晶体为单斜针状，晶体的形状规则且均一，并且具有较高的结晶收率。结论：与不使用结晶工艺相比，直接调成冻干后收集产品不仅能够显著地提高收率，也能有效地减少冻干时间。因此门冬胰岛素原料药的结晶方法具有良好的结晶收率，能够显著地降低原料药的生产损失，适合于工业化的大量生产。

【关键词】稳定；门冬胰岛素；结晶；制备方法

门冬胰岛素属于蛋白类生物大分子，由于其为生物大分子，因此在体外难以保持其独有的完整生物活性，因此在研究中该如何保持此类分子的基本完整的生物活性，一直以来是相关人员的研究重点工作。晶体结构的存在对于生物大分子是处于较为稳定的状况，与其他小分子物质相同，蛋白质晶体是按分子单元一定的排列顺序堆积而成的，因而便能形成一个较为独特的空间点群，其在外观的表现上主要为其具有不同规则的集合行政固体，蛋白质晶体与无定形态相比具有较高而定生物活性与理化稳定性。生物蛋白类药物大分子的存在形式为晶体，给药方式为晶体，此种给药方式能够显著地提高药物的稳定性，同时也能够提高药物的有效成分浓度，因而在临床应用中具有可控性释放等优点。血糖类药物中胰岛素及其类似物作为其中有效且重要的药物，从未间断对其结晶的研究。但目前由于尚未得到理想的质量优异胰岛素及其类似物晶体的生产工艺，因此现阶段我国胰岛素及其类似物所面临的主要问题仍然为如何进一步对结晶技术与条件进行优化。

1材料与方法

1.1实验材料

门冬胰岛素，主要试剂包括甘氨酸、乙酸锌、水饱和酚、乙酸、氯化钠、氢氧化铵、盐酸、乙腈；其余试剂至少为分析纯。主要仪器包括电子天平、微孔溶液过滤器、PH计、光学显微镜、超高效液相色谱仪。

1.2实验方法

1.2.1有机酸体系

备制3批剂量为30ml的结晶体系，乙酸含量分别为0.5M、1.0M及1.5M，将门冬胰岛素制备液蛋白浓度稀释至2.5goL^-4，苯酚：体积分数含量为0.2%，将pH用氨水将其调至pH6.0，加入剂量为200mgoLq的乙酸锌，在恒温20-24℃的环境中将其进行长达10h的搅拌，并将温度调到2-8℃左右，并停止对结晶的搅拌。而在第2个实验进行中，将乙酸改为柠檬酸，在第3个实验进行中，则将乙酸改为甘氨酸。对晶型效果的观察采用显微镜图片进行分析，旨在对合适浓度的有机酸进行优化。

1.2.2有机溶剂

通常情况下，有机溶剂在精纯之后得到的门冬胰岛素其本身便具有一定的乙腈含量，为了能够尽可能地减少给原料带入不同的杂质，因此在实验的过程中对于有机溶剂可以选择乙腈。在第4个实验中，在对有机酸体系进行筛选的过程中，分别加入体积含数分别为10%、15%以及20%的乙腈。对晶型效果的觀察采用显微镜图片进行分析，旨在对合适浓度的乙腈进行优化。

1.2.3盐

在对盐进行选择的过程中，可以通过结晶液中盐的过饱和度来进一步推进结晶形成。第5个实验室在已经筛选的体系下分别加入含量为0.1M、0.2M以及0.3M的氯化钠。对晶型效果的观察采用显微镜图片进行分析，旨在对合适浓度的氯化钠进行优化。

1.2.4pH

根据相关的研究资料表明，在门冬胰岛素等电点附近其具有最低的溶解度，在是实际实验的过程中发现，在其中加入一定量的醋酸锌后在一定程度上升高pH值。试验结果表明，在对pH进行调节的过程中最好的方式是在加入锌离子前操作，因此，在加入并混匀除锌离子之外的各物质后，再对pH值进行调节，然后在此基础上加入醋酸锌。第6个实验则表明在已经筛选出的体系基础上，分别选取4.5、6.0以及7.5pH。对显微镜图片进行分析并比较结晶收率来对合适的pH进行筛选。

2结果

在前3个实验结果中表明，有机酸在浓度为0.5M-1.5M之间时，其种类能够对门冬胰岛素结晶造成较大影响。在选择浓度为1.0M甘氨酸体系中，分别加入体积分数含量为10%、15%及20%的乙腈具有非常好的结晶，且晶体形状规则。在已经筛选的体系下分别加入含量为0.1M、0.2M以及0.3M的氯化钠中，在放大64倍的条件下晶体形状仍然规则，其中3a结晶的颗粒型晶体较多，但3c的结晶具有长短不一的特点。实验中发现pH能够在很大程度上对结晶造成影响，在放大64倍的条件下晶体形状仍然规则，其中4a结晶的颗粒较为细小，但4c的结晶具有长短及宽度不一的特点。

3讨论

门冬胰岛素属于一种速效的胰岛素类似物，具体方式是通过重组DNA技术替换人胰岛素B链第28位Pru，使其成为Asp，此种方式改变了氨基酸，同时也对胰岛素单体分子造成破坏，从而使其难以形成二聚体，也在一定程度上降低了分子间的聚合力。所以对人胰岛素相比，门冬胰岛素相更加容易形成一个单体，此种方式能够对皮下吸收速率进行加速，也相对地缩短了起效时间与持续时间。门冬胰岛素与可溶性的人胰岛素比较而言，门冬胰岛素的药代动力学特性占常规人胰岛素的1/2左右，起效的时间在10-20分钟之间，达峰在30-40分钟之间，持续作用的时间在3-6小时。由于其皮下吸收的速度更快，因而便能够显著地对餐后血糖进行控制，同时由于其作用时间不长，因而便能有效地降低患者低血糖风险。近年来，随着市面上胰岛素的类似物种类越来越丰富，也随之加快了胰岛素类似物结晶的发展，且蛋白晶体能够对蛋白稳定性起到很好的维持作用。在临床上对血糖类药物进行有效控制中，胰岛素及其类似物作为其重要的手段，对于其结晶的研究从未间断。氯化锌与乙酸锌在甘氨酸体系中的引入均会在一定程度上降低pH，根据相关的实验结果表明，调节pH的最好方式是在加入锌离子前进行操作。主要原因在于通常情况下，我们认为加入锌离子便意味着结晶的开始，若在加入锌离子后再对pH进行调节，则会对晶体成核形态造成影响，最终会对晶体的均一性造成影响。因此，这就要求在除锌离子以外的各类物质加完并混匀后，再将pH调节为6.0-6.5之间，并在此基础上加入锌离子，此时pH便会降至5.5-6.0左右。由于此项操作能够在很大程度上减少结晶过程中的动力干扰，因而便能够使晶体的形成更加均一。除此之外，在实验中对于结晶液中的锌的加入形式通常为锌盐，其用量按照锌离子与胰岛素摩尔比，可以得出乙酸锌与氯化锌均为其代表性的锌盐，本次试验中考虑到结晶的工艺，因而选择乙酸锌作为锌的代表。通过本次试验显示，有机酸适宜采用浓度为0.5M-1.5M之间的甘氨酸，乙腈、苯酚及氯化钠溶液采取体积分数12%-18%、0.2%-0.3%、0.2M-0.3M，同时还包括含量为门冬胰岛素制备液蛋白浓度稀释至2.0-5.0g·L-1重组门冬胰岛素。在条件为pH在6.0-6.5环境下加入醋酸锌组成的结晶液，经过放大验证能够得到的晶体为单斜针状，晶体的形状规则且均一，并且具有较高的结晶收率。除此之外，此种方式具有较高的生产效率与较短的冻干时间，因此在原料药的生产的过程中能有效减少其损失，最终提高其产品收率。结果表明，与不使用结晶工艺相比，直接调成冻干后收集产品不仅能够显著地提高收率，也能有效地减少冻干时间。除此之外，开发门冬胰岛素结晶工艺能够显著地降低胰岛素产品生产成本，在市场上有效地提高国产胰岛素竞争力。

综上所述，门冬胰岛素原料药的结晶方法具有良好的结晶收率，能有效地减少原料药生产损失，提高市场竞争力。