黄芩苷对LPS致流产小鼠的子宫局部免疫调节机制研究*

马雁南 ，杨小颀

（1.陕西中医药大学，咸阳 712046；2.宝鸡市第二中医医院妇产科，宝鸡 721300；3.陕西中医药大学第二附属医院生殖科，咸阳 712046）

妊娠是一个既复杂又协调的生理过程，当其中任何一个环节发生异常，都将导致流产的发生。临床上，对妊娠28周内，胎儿体重不足1 000 g而终止者称之为“流产”[1]，中医则称之为“胎漏、胎动不安”[2]。据统计，约31%的胚胎着床后发生流产[1]，这一病理现象的发生正呈现逐年上升趋势，已严重影响育龄女性的身心健康[3]。

胚胎遗传并在发育全过程中携带一半父系抗原，其作为异己抗原，不仅在妊娠过程中未遭到母体子宫明显的免疫排斥，相反却与其和平相处，足以证明母体子宫通过一定的免疫调节行为促成免疫耐受机制，促使妊娠过程安全有序进行，而一旦这种稳定的免疫机制失调，势必将导致流产等现象发生，正如Duclos[4-5]等研究证实，细菌脂多糖（LPS）可在子宫局部产生大量肿瘤坏死因子-α（TNF-α），致使胚胎丢失，亦即发生流产行为。

近年来随着生殖免疫研究的精准化深入，诸多研究发现妊娠免疫耐受的形成与子宫局部的细胞因子密切相关，其中最为经典的是Th1/Th2细胞因子的平衡模式，Th1和Th2型细胞均由Th0分化而来，Th1型细胞分泌的细胞因子主要包含IFN-γ、TNF-α、IL-2等，可对胚胎造成免疫损伤，而Th2型细胞分泌的细胞因子则主要包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，对胚胎则起免疫保护作用，正常妊娠时，母胎界面以Th2型反应占优势[6-9]，也就是母体子宫分化发育产生的Th2型免疫细胞分泌相细胞因子诸如：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等应在子宫与胚胎间建立免疫耐受过程中发挥强势作用[6-7]。因此，如若在胚胎发育期，人为干预增强子宫局部Th2型免疫细胞或减弱Th1型免疫细胞作用，将会促使免疫耐受，并对胚胎发育产生积极影响，起到“安胎”的积极作用。

黄芩初载于《神农本草经》，其性凉味苦，具有清热安胎的作用[8-9]。中药安胎历史悠久，黄芩亦在诸多安胎方剂中出现并沿用至今，其主要成分之一黄芩苷的安胎效果已被临床实践所证实[10-12]，但其是否是在母胎界面局部免疫调节中发挥作用，且其相关作用机制却鲜未报导。

本实验选用LPS诱导流产小鼠模型，在黄芩苷干预下经ELISA测试方法检测其子宫组织中TNF-α、IL-10的含量变化情况，旨在研究黄芩苷是如何通过调节子宫局部母-胎界面免疫状态来发挥安胎作用，从免疫学角度来探讨黄芩苷的安胎机制，为中医学中黄芩“清热安胎”理论提供确凿科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及药品 细菌脂多糖（Lipopolysaccharide from E coli.O111B4），Sigma 公司产品 ； 黄 芩 苷（Baicalin），购于博奥生物医药科技有限公司；小鼠TNF-α、IL-10ELISA测试盒,BioSource产品；蛋白酶抑制剂（Aprotinin），Biosharp产品。

1.2 试验动物 6～8周龄SPF级昆明雌鼠，体质量20～22 g（购于第四军医大学实验动物中心），经常规饲养适应环境1周后,阴道涂片法挑选出处于动情期雌鼠，与雄鼠2∶1合笼交配，次晨检出阴栓者，记为孕0 d。

1.3 动物分组及处理 受孕小鼠随机分为空白组（A组）、LPS处理组（B组）、LPS及黄芩苷处理组（C组）、黄芩苷处理组（D组）(见表1)，各组样本数量均为10只。B、C组孕鼠分别于孕7 d给予尾静脉注射LPS 0.1 μg（0.2 mL）制作流产模型，A、D 组孕 7 d 尾静脉注射PBS 0.2 mL。LPS处理组自孕4 d开始连续灌胃（磷酸盐缓冲液 0.4 mL/d），共 4 d；C、D 组自孕4 d开始连续灌胃[黄芩苷液0.4 mL/（1 mg·d）]，共4 d（见表1）。孕9 d后采用颈椎脱臼法处死所有孕鼠。

1.4 胚胎吸收率和流产率计算 孕9 d处死孕鼠后打开腹腔，充分暴露子宫，观察子宫生长情况，记录胚胎着床数目和胚胎吸收数目。

发育正常的胚胎形状似串珠，色泽光鲜，大小均一，胚胎的中间部位可见红色条索状胎盘。而发育异常子宫呈黑紫或褐色，内可见陈旧性出血或伴血凝块，体积明显变小，部分胚胎萎缩或消失。解剖镜下观察，模糊一片无正常胚胎结构。

胚胎吸收率及流产率的计算公式：

胚胎吸收率=吸收胚胎数/（吸收胚胎数+存活胚胎数）×100%

流产率=流产母鼠数/试验组母鼠总数×100%

1.5 试验取样 在冰盒上完整取出各组子宫，除去系膜及脂肪组织后称重。纵向剖开子宫，完整剥离胚胎后，剪下右侧子宫角称量净重，加入pH=7.4磷酸盐缓冲液（内含6倍量0.75μg/mg的蛋白酶抑制剂），立即在低温环境中（4℃）进行匀浆，12 000 r/min离心15 min后取上清液分装，-80℃冻存，用于ELSIA测定TNF-α、IL-10的含量。左侧子宫剪除后，用眼科剪分离蜕膜组织，剪成1 cm×1 cm大小，铺平放入组织盒，置于70%乙醇中固定，用于HE染色。

1.6 ELISA测定子宫组织中的TNF-α、IL-10的含量 遵照试剂盒说明书操作，反应终止后，在酶标仪450 nm波长处读取吸光度（OD）值，利用标准曲线计算TNF-α、IL-10的含量。

1.7 统计分析 所有数据使用Excel 2000和SPSS 18.0软件包进行统计，卡方检验分析组间差异显著性。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，P＜0.05 差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 流产率、胚胎吸收率比较 空白组10只孕鼠中2只发生流产，流产率为20%，其总计86枚胚胎中83枚为正常胚胎，且胚胎组织新鲜，少见出血、坏死，胚胎吸收率分别为3.4%。LPS处理组中10只孕鼠均发生流产，子宫内无存活胚胎，部分胚胎已经溶化，流产率及胚胎吸收率均为100%，与空白组比较有统计学差异（P＜0.01）。C组的流产率20%及胚胎吸收率为3.3%，近似空白组，两组差异无统计学意义（P＞0.05），但与LPS处理组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。D组流产率及胚胎吸收率均为0，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各处理组妊娠结果

表1中A、B两组实验数据对比差异显著（P＜0.01），说明LPS具有明显致流产的作用；B、C组对比差异显著（P＜0.01），说明黄芩苷能够有效干预LPS导致的妊娠小鼠产生流产行为；A、D组对比有差异，（P＜0.05），说明黄芩苷在妊娠过程中起到积极促进作用，具有安胎功效。

2.2 子宫组织中免疫因子含量比较分析

2.2.1 TNF-α含量对比 LPS处理组子宫组织中TNF-α含量最高，与A、C组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；C组子宫组织中TNF-α在黄芩苷干预下含量无明显升高，与空白组数值接近，差异无统计学意义（P＞0.05）；D组子宫组织中TNF-α含量最低，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 子宫组织中TNF-α、IL-10的含量

2.2.2 IL-10含量对比 LPS处理组子宫组织中IL-10含量明显减少，低于空白组，与A、C组的差异有统计学意义（P＜0.01）；C组子宫组织中在黄芩苷干预下IL-10的含量升高明显，与LPS处理组差异有统计学意义（P＜0.01），与空白组差异无统计学意义（P＞0.05）；D组中IL-10的含量最高，与空白组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2.3 TNF-α/IL-10比值对比 通过表2中四组数据对比发现，LPS处理组TNF-α/IL-10比值最大（为1.673±0.034），与A、C、D组差异有统计学意义（P＜0.01）；C、D 组的 TNF-α/IL-10比值均低于空白组，其中D组最低（为0.115±0.045 4），均与空白组相比有差异。

2.3 子宫蜕膜组织的变化 HE染色结果如图。空白组子宫腺体清晰可见，子宫蜕膜细胞排列整齐，大小均匀，数量正常。LPS处理组显示蜕膜细胞碎裂，数量明显减少，大量炎细胞浸润，局部难以见子宫腺体。C组显示蜕膜细胞数量增多，核增大，子宫腺体可见。D组显示蜕膜细胞明显增多，排列整齐，核增大，腺体清晰可见。

2.4 实验结论 本实验中，在黄芩苷的干预下，不论是C组，还是D组，在流产率、胚胎吸收率方面对照LPS处理组、空白组，均显著降低且具有统计学意义，充分证明黄芩苷具有确切的安胎作用；同时，在子宫局部免疫调节因子含量方面，受黄芩苷干预作用，代表Th1型细胞途径之一的TNF-α因子含量显著降低，代表Th2型细胞途径之一的IL-10含量显著升高，使得子宫局部免疫耐受机制偏向Th2占优势趋势方向发展。这也充分证明黄芩苷既可上调Th2细胞作用，释放大量IL-10，促进子宫局部建立免疫耐受机制，降低流产率和胚胎吸收率，又可抑制Th1细胞，使得巨噬细胞分泌的TNF-α因子显著减少，降低了子宫对胚胎的细胞免疫效应，降低流产率和胚胎吸收率，综合作用的结果使母胎微环境向着Th2占优势的平衡转变，具有良好的安胎效果。

图1 各组子宫蜕膜组织HE染色结果

3 讨论

何丽君[13]等认为，TNF-α因子在机体免疫调节中发挥双重调节作用，即适量的TNF-α可调节机体的免疫及代谢功能,对维持稳定状态和抵制各种疾病因子具有重要意义,而过量的TNF-α却可导致多种病理改变[14]。通过本实验可发现，空白组（A）条件下，子宫局部存在适量的TNF-α因子，维持子宫局部正常的免疫调节。而细菌脂多糖LPS处理组（B）小鼠发生流产现象，正是由于LPS诱导活化Th1型细胞，释放大量的IFN-γ，刺激子宫局部分泌过量巨噬细胞，而导致过多的巨噬细胞分泌产生过量TNF-α因子，进而诱导有害物质产生，对子宫局部和胚胎造成放大免疫反应的影响，导致胚胎丢失。付锦华[15]等认为，胚胎进入子宫后，母胎之间适应性与相容性受到IL-10的作用，即由Th2型细胞分泌产生IL-10因子在母胎界面免疫调节中促进免疫耐受机制发生，使母胎相互相容、适应。本实验中，在LPS处理（B）干预下，母胎界面免疫平衡被打破，Th1型途径占优势，抑制了Th2途径，使得IL-10因子明显减少，导致流产率、胚胎吸收率明显升高，这也从另一方面证实IL-10因子在主导Th2型细胞途径安胎机制中发挥重要作用。近年来，诸多学者在生殖免疫领域研究发现，黄芩及其有效成分能够明显调节机体的免疫功能状态，尤其在妊娠期子宫局部发挥着重要的调节作用。本研究不仅证明黄芩苷在小鼠子宫局部免疫调节中，可通过促进Th2型途径发挥良好安胎作用，同时在抑制Th1型免疫细胞产生TNF-α因子，避免胚胎丢失方面亦发挥作用，可谓黄芩苷在子宫局部免疫调节中发挥双重机制作用，却殊途同归于安胎。