发酵液中alpha-酮戊二酸的提取

裴 莹，孙玉波，黄 斌

(四川理工学院 化学工程学院 化学工程系，四川 自贡 643000)

0 引言

alpha-酮戊二酸(α-酮戊二酸，又α-KG)分子式为C5H6O5，是一种白色、无嗅细结晶性粉末，易潮解，易溶于醇、水、 极难溶于醚.alpha-酮戊二酸是一种重要的短链羧酸分子，是微生物细胞中三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle)中连接碳代谢和氮代谢重要的代谢中间产物，能表征细胞中的碳-氮平衡水平，在机体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成并调控多种能量代谢，是一种重要的营养物质，在各个领域都具有重要的应用价值[1,2].alpha-酮戊二酸可以减轻肾病患者的肾脏负担、促进患者手术后快速恢复和减少并发症，因此在医学领域具有重要的应用价值；alpha-酮戊二酸能迅速帮助人体补充能量，恢复人体机能，因此在食品领域具有广泛的应用前景；此外，alpha-酮戊二酸因为其特殊的化学性质还广泛应用于化学有机合成领域[2].

目前，采用微生物发酵法生产alpha-酮戊二酸成为最佳选择，也成为研究热点和主要生产方法[2].但是，由于发酵液中存在杂菌、丙酮酸、盐类等杂质，且其中alpha-酮戊二酸的含量低，因此在发酵液中提取alpha-酮戊二酸难度较大，到目前为止报道的只有沉淀法和离子交换法两种方法从发酵液中提取alpha-酮戊二酸.但是沉淀法的收率低，工艺过程较复杂，在实际生产过程中受到限制；而离子交换法的投资操作费用高，同时会产生废酸或废碱等，因此本研究的目的在于找到一种恰当的方法来分离、提纯发酵液中的alpha-酮戊二酸.目前较为理想的方法为双水相萃取.

双水相体系是指在水溶液中加入与水混溶的有机溶剂(如丙酮)和无机盐(如磷酸氢二钾)使互溶的两相分离，其中一相富含有机物，另一相富含无机盐.它的形成机制从溶液理论来说，取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力.双水相萃取技术是新型分离技术，日益受到人们的重视，与传统的萃取分离技术相比具有含水量高、操作条件温和、界面张力低、分离迅速、分离提纯效率高、过程易于放大、易于连续操作、成本低、低毒性等特点，因此在生物工程、天然药物和生物活性物质的分离提取方面有着广泛的应用[3].并且目前国内外鲜有对双水相萃取发酵液中alpha-酮戊二酸的相关研究，基于此，本研究主要采用无机盐-低分子有机溶剂形成的双水相体系[4]萃取发酵液中的alpha-酮戊二酸.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-酮戊二酸发酵液(葡萄糖发酵液、甘油发酵液)，四川龙蟒福生科技有限责任公司；丙酮 ，重庆川东化工(集团)有限公司；磷酸氢二钾(三水)，成都市科龙化工试剂厂；α-酮戊二酸(含量≥99%)，上海源叶生物科技有限公司.试验用试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

电子分析天平Scout SE，奥豪斯仪器(常州)有限公司；循环水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)，巩义市仪器予华仪器有限责任公司；电热恒温水浴锅DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特仪器有限公司；双光束紫外可见光分光光度计DH-2000-BAL，美国海洋光学公司；电热鼓风干燥箱DHG-9070A，常州普天仪器制造有限公司.

1.3 方法

1.3.1 双水相萃取基本原理

双水相萃取是利用物质在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现分离的分离方法.由于萃取体系的性质不同，在被分离物质进入双水相体系后，由于分子间的范德华瓦尔斯力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷作用的存在和环境因素的影响，使其在静置分层时被分离物质在两相中的浓度不同，然后将富集了被分离成分的相分离出来，再经过处理后就可得到被分离成分，从而达到分离的目的[5].

低分子有机溶剂-无机盐双水相体系成相的基本原理是盐相、有机相与水分子缔合竞争，形成缔合水合物[5].溶质在双水相体系中服从Nernst分配定律，溶质在两相中浓度比等于常数，分离效果由分配系数来表征，它涉及表面性质(表面自由能)、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)等，使其在上、下相中的浓度不同[6].

相关计算公式如下：

式中：K为分配系数;Ct和Cb分别为alpha-酮戊二酸在双水相体系上、下两相中的浓度，g/L；R为相比；Vt和Vb分别为双水相体系上、下相的体积，mL；E为alpha-酮戊二酸的萃取效率.

1.3.2 双水相体系的相图绘制

水溶液两相的形成条件和定量关系常用相图来表示，它是一条双界线，当两相的组成位于曲线的上方时体系就会分成两相.采用浊度法[7,8]绘制丙酮/K2HPO4·3H2O双水相体系的相图，确定合适的双水相体系(见图1).由图1可以看出，K2HPO4·3H2O与丙酮形成的稳定的双水相体系，所需丙酮量较少且成相范围较宽.

图1 丙酮/K2HPO4·3H2O双水相体系相图Fig. 1 acetone/K2HPO4·3H2O aqueoustwo-phase system phase diagram

1.3.3 标准曲线的绘制

采用双光束紫外可见光分光光度计，测定alpha-酮戊二酸标准品的吸光值，确定最佳吸收波长为235.14 nm，并绘制标准曲线，确定标准曲线的回归方程为C=1.8239A+0.0128(R2=0.999)，alpha-酮戊二酸溶液在0.005～0.250 g/L的范围内，质量浓度与吸光度呈线性关系.

1.3.4 实验方法

按质量配制一定比例的双水相体系，系统总量为40 g(其中发酵液添加量为25%，10 g).加入10 g发酵液与之混合，搅拌均匀，形成上、下相，静置10 min后分液，读取上、下相体积并分别进行减压蒸馏除去丙酮，测定上、下相中alpha-酮戊二酸的吸光值，计算分配系数、相比和萃取率[9].采用单因素试验和正交试验方法探讨萃取过程中各因素对alpha-酮戊二酸萃取率的影响，并确定最佳的提取分离工艺条件[10].

2 结果与分析

2.1 双水相体系中磷酸盐加入量的确定

实验结果如图2所示，alpha-酮戊二酸的分配系数(K)随着体系中磷酸盐加入量的增大呈下降趋势，原因是随着盐相用量的增大，其竞争缔合水分子的能力增强，导致上相中更多的水分被竞争吸附到下相中，使上相体积减小，相比减小，而水分会带动一部分alpha-酮戊二酸进入下相，使上相中alpha-酮戊二酸浓度降低，下相浓度上升，从而导致alpha-酮戊二酸在两相的分配系数降低，萃取率(E)降低.在K2HPO4·3H2O加入量为6 g时，alpha-酮戊二酸的萃取率达到了最高，为85.39%.根据实验和相图可知，磷酸盐加入量不能低于6 g，否则将不能成相.

图2 K2HPO4·3H2O用量的影响Fig. 2 Effects of dipotassium hydrogen phosphate trihydrate dosage

2.2 双水相体系中丙酮加入量的确定

实验结果如图3所示，alpha-酮戊二酸的分配系数随着体系中丙酮加入量的增大而减小，原因是随着有机相用量的增大，亲水性有机溶剂丙酮竞争水分子的能力增强，使下相中更多的水分被竞争吸附到上相，同时，上相中的部分有机溶剂被挤入到下相中，使得两相的相比基本不变，所以上相中的alpha-酮戊二酸被稀释，alpha-酮戊二酸在上相的浓度降低，在下相的浓度增加，使得分配系数降低，从而导致萃取率降低.所以在丙酮加入量为8 g时，萃取率最高，为87.30%.

图3 丙酮用量的影响Fig. 3 Effects of acetone dosage

2.3 萃取温度的确定

实验结果如图4所示，alpha-酮戊二酸的分配系数随着萃取温度的升高，呈先上升后下降的趋势.通过实验发现，温度对相比的影响不大，当温度升高时，alpha-酮戊二酸在上、下相的溶解度都会增大，且其在上相有机溶剂中的溶解度比在下相水中的大，使分配系数增加，有利于萃取，但是随着温度持续升高，分子运动加剧，部分alpha-酮戊二酸分子进入到下相中，使得alpha-酮戊二酸在上相的浓度降低，在下相的浓度增加，使得分配系数降低，萃取率降低.并且温度升高，体系中各分子间的相互作用加强，影响相界面间的传质以及体系的稳定性，不利于被分离物质的选择性分配，对萃取不利.但温度也不宜过低，温度降低，分子运动减弱，影响体系成相过程，使分相时间增加.故选择20 ℃～30 ℃的温度进行萃取比较适宜.

图4 萃取温度的影响Fig. 4 Effects of extraction temperature

2.4 最佳双水相体系的确定及验证

系统总量40 g，以丙酮(A,g)、K2HPO4·3H2O(B,g)和萃取温度(C,℃)为3因素进行L9(33)正交试验，因素水平见表1，试验结果及计算见表2.

表1 正交试验因素水平表Tab. 1 Factors and their coded levels inorthogonal array design

表2 正交试验设计及结果Tab. 2 Orthogonal array design andcorresponding experimental results

由表1、表2可知，各因素对alpha-酮戊二酸萃取率的影响大小为：B>C>A；最佳工艺条件为A3B1C3，即丙酮9.6 g，K2HPO4·3H2O 6 g，萃取温度30 ℃.以最佳工艺条件进行3组验证实验，数据处理取均值得：相比R=2.5，分配系数K=2.75，萃取率E=87.56%.由此可见，在最佳工艺条件下，丙酮/K2HPO4·3H2O双水相体系对alpha-酮戊二酸具有比较稳定且较好的分离提纯效果.

3 结论

本实验通过双水相体系萃取alpha-酮戊二酸，主要研究了丙酮用量、K2HPO4·3H2O用量和萃取温度对alpha-酮戊二酸分配系数和萃取率的影响，在此基础上进行了系统试验，确定了一种比较稳定的双水相萃取体系.利用丙酮/K2HPO4·3H2O双水相体系提取分离alpha-酮戊二酸，系统总量为40 g，丙酮用量9.6 g，K2HPO4·3H2O用量6 g，萃取温度30 ℃，相比为2.5，分配系数为2.75，萃取率可达到87.56%.采用丙酮/K2HPO4·3H2O双水相体系萃取分离alpha-酮戊二酸，其萃取效率较好，这种低分子有机溶剂和无机盐的新型双水相体系分离时间短、效率高等优点，且在后续工艺中两相物质易回收、资源可重复利用，很大程度上节约了成本.并且用这种新型双水相体系萃取alpha-酮戊二酸还未见有报道，我们还可以进一步地深入探讨.