低温等离子体冷杀菌对生鲜牛肉主要腐败菌及生物胺抑制效应研究

黄明明, 乔维维, 章建浩,*, 王佳媚,2,*

(1.南京农业大学江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心/国家肉品质量安全控制工程技术研究中心/食品科学技术学院,江苏南京 210095;2.海南大学食品学院,海南海口 570228)

牛肉富含蛋白质、碳水化合物以及矿物质,其氨基酸模式与人体相近,具有很高的生物价。在合适的环境条件下,微生物以牛肉为温床生长繁殖,造成牛肉中病原体和毒素的积累以及肉品的腐败变质,对肉品色泽、气味、表观质构以及食用安全方面造成不可逆的不利影响。因此在生产、加工、运输和销售过程中肉制品的交叉感染等安全问题成为消费者和生产者关注的焦点。

生物胺是一类由氨基酸脱羧或脱醛和酮氨基化而形成的含氮脂肪族、芳香族或杂环类低分子量有机化合物的总称[1]。过量摄入生物胺会引起头疼、恶心、心悸、血压变化和呼吸紊乱等过敏反应[2]。传统的冷藏技术和气调保鲜技术虽然可以有效地延长肉制品的贮藏期但无法达到有效杀菌和解毒的目的,其他冷杀菌技术存在设备成本过高、杀菌效率差及消费者接受度低等问题[3-4]。等离子体是指在高电压作用下,中性气体分子离解产生的正负电荷总量相等的离子、电子、自由基以及亚稳态粒子。等离子体冷杀菌技术是在大气压条件下产生的处理温度不超过室温的非平衡等离子体,在等离子体腔室中产生的活性氧及活性氮自由基、亚稳态粒子、紫外光子和电场都具很强的杀菌效果。研究发现,活性氧、活性氮自由基可以有效地造成生物大分子(蛋白质、脂质)的氧化变性,紫外照射可以引起DNA结构的变化,多种等离子体活性物质共同协同作用造成微生物的快速死亡,达到杀菌保鲜的目的。在肉及肉制品的杀菌效果方面,已有研究报道,Kim等[5]采用低温等离子体处理培根切片,具有很好的杀菌效果,培根的L值呈升高趋势,但a值无显著变化。Misra等[6]应用氮气源激发的等离子体处理猪肉,可以有效杀死并抑制微生物生长,并且在贮藏过程中猪肉颜色和pH值均未有显著变化。

本文研究低温等离子体冷杀菌(cold plasma cold sterilization,CPCS)协同气调保鲜技术(modified atmosphere packaging,MAP)处理对冷藏过程中牛肉主要微生物菌属、挥发性盐基氮含量、脂质氧化以及主要生物胺含量的影响,分析CPCS协同MAP杀菌对牛肉品质的影响,为低温等离子体冷杀菌技术在生鲜牛肉保鲜包装中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

牛背最长肌购于南京苏果超市(卫岗店),置于冰盒中运回实验室备用;高氯酸、碳酸钾、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、色胺(tryptamine,TRY)、苯乙胺(phenylethylamine,PHE)、尸胺(cadaverine,CAD)、腐胺(putrescine,PUT)、组胺(histamine,HIS)、酪胺(tyramine,TYR)、亚精胺(spermidine,SPD)、精胺(spermine,SPM),分析纯,购于美国Sigma公司;微生物用培养基购于青岛海博公司。

1.2 主要仪器与设备

MAP-H360型复合气调保鲜包装机(配有气体比例检测装置),苏州森瑞保鲜设备有限公司;低温等离子体发生器(配有电压调控箱,可控电压0～90 kV),美国Phoenix公司;XC07-II型无菌拍打式均质器,南京宁凯仪器有限公司;SJ-CJ-1D型超净工作台,苏洁净化仪器设备有限公司;SMIC型电热灭菌锅,上海申安医用仪器厂;IKA T25型组织分散机(配有S25N-10G分散刀头),德国艾卡仪器设备有限公司;电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;KH-400KDB型高功率数控超声波清洗器(超声频率40KHz),昆山禾创超声仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理方法

剔除原料肉表面筋膜,按照肌纤维的方向切成约50 g的肉块,随机分为2组,每组15块,放入包装盒(上海中央化工公司,透氧率=10 cm3/(m2·24 h))按照 V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)=35% ∶35% ∶30% 的气调比例进行气调包装,采用阻氧膜(美国Sealed Air公司,透氧率=25 cm3/(m2·24 h))热封包装。包装样品用CPCS处理,处理电压72 kV,处理时间85 s。处理后的样品置于4℃贮藏,在0、1、4、7、10 d时随机抽取3盒测定相关指标。气调包装组用MAP表示,CPCS协同气调包装组用CPCS+MAP表示。

1.3.2 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》的方法执行。用灭菌剪刀将牛肉剪碎,称取25 g牛肉放入225 mL灭菌生理盐水中,均质器2次/s拍打40 s,然后按10倍梯度稀释到合适的稀释度。每个稀释度倾注3个平板,取平均值。各类微生物培养条件如表1。

表1 微生物培养条件Tab.1 Incubation conditions of microorganism

1.3.3 挥发性盐基氮含量测定

挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVBN)的测定采用微量扩散法参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[7],并稍作修改。

1.3.4 硫代巴比妥酸值测定

准确称取5.00 g牛肉,加入20 mL蒸馏水和25 mLφ=20%三氯乙酸溶液,匀浆后静置离心(5 000 r/min,10 min),过滤并定容至50 mL,吸取4.00 mL溶液加入4.00 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液,沸水浴加热20 min使其形成粉红色。冷却,于532 nm测定吸光值。空白组：2.00 mLφ=7.5%含w=0.1%EDTA的三氯乙酸加入等体积的硫代巴比妥酸溶液。TBARs值通过标准曲线测定,单位为mg MDA/kg。

1.3.5 生物胺的测定

1.3.5.1 标准溶液配制与柱前衍生

参照文献[8]的方法并稍作改进。精确配制色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺8种生物胺的梯度标准溶液,使其质量浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL。 取标准溶液1.00 mL,依次加入200μL 2 mol/L NaOH,300μL饱和NaHCO3溶液,2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液,40℃下避光反应45 min,加入100μL 25%的氨水,静置30 min,用乙腈定容至5 mL,过0.22μm的滤膜待测。

1.3.5.2 样品处理

取牛肉5.00 g绞碎,加入 c=0.4 mol/L的HClO4溶液20 mL匀浆,然后使用超声波提取仪提取30 min,于4℃条件下,以3 000 g离心10 min,取上清液,沉淀部分复溶后再提取一次。合并两次上清液,使用c=0.4 mol/L的HClO4溶液定容至50 mL,从中取出1.00 mL的样品溶液进行柱前衍生,方法同标准溶液的处理。根据标准曲线,将所测得的生物胺含量以mg/kg肌肉表示,所有测定重复3次。

1.3.5.3 色谱条件

处理好的样品采用高效液相色谱法进行测定,色谱仪为Waters 2690系统(Waters,Milford MA),色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250 mm,5μm),254 nm紫外检测,流速1 mL/min,进样量20μL,柱温35℃,流动相A为水,B为乙腈。梯度洗脱程序为0～5 minφA35%至30%;5～20 minφA30%至70%;20～24 min,φA0%;24～25 minφa0% 至 35%;25～30 min,φA35%。

1.3.6 数据处理

采用SPSS软件进行方差分析,处理组和贮藏天数为固定因子,样品为随机因子进行一般线性模型分析,不同处理间差异显著性采用 Duncan's多重比较分析,显著水平为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 微生物含量的变化

牛肉经CPCS协同MAP处理后在贮藏过程中主要微生物数量变化见表2,在贮藏过程中(1～10 d),CPCS+MAP处理组菌落总数及各类微生物含量显著低于MAP处理组。在贮藏过程中CPCS+MAP处理组菌落总数呈现出先下降后上升的趋势,在贮藏期第1天和第4天,菌落总数显著低于第0天,这表明CPCS处理具有很好的杀菌效果。在贮藏期第10天,CPCS+MAP和MAP处理组菌落总数分别为5.76 lg(CFU/g)和7.46 lg(CFU/g),这表明CPCS处理在杀菌的同时还能达到抑菌的效果。

表2 牛肉贮藏过程中主要微生物含量变化Tab.2 Total colony counts of beef during storage lg(CFU/g)

贮藏过程中微生物菌属变化如图1。牛肉中主要微生物菌属随着贮藏时间延长,呈现出不同的增长状况。由图1可知,在贮藏初期假单胞菌含量最高,占菌落总数的39.8%。在贮藏期第10天,牛肉中优势菌由假单胞菌变为乳酸菌,在 MAP组和CPCS+MAP组中分别占菌落总数的60.3%和63.1%。在贮藏后期MAP处理组中各菌属浓度大小依次为：乳酸菌、假单胞菌、热杀索丝菌、微球菌和肠杆菌;在CPCS+MAP处理组中各菌属浓度大小也是乳酸菌、假单胞菌、热杀索丝菌、微球菌和肠杆菌。因此低温等离子体处理对牛肉贮藏过程中菌属的变化并无显著作用。

图1 贮藏过程中微生物菌属变化Fig.1 Changes in microbial flora during storage

2.2 硫代巴比妥酸值的含量变化

硫代巴比妥酸值 (thiobarbituric acid values,TBARs)主要用于脂质初级氧化产物被进一步氧化形成二次氧化程度的评判,代表脂质氧化形成的丙二醛(malondialdehyde,MDA)等化合物的含量,一般用来衡量牛肉中脂质的氧化程度。对贮藏中牛肉的TBARs值进行测量见图2,可知随着贮藏时间延长各处理组牛肉中TBARs含量均显著上升(p＜0.05),在贮藏过程中CPCS+MAP处理组牛肉中的TBARs值始终显著高于MAP对照组(p＜0.05)。

图2 牛肉储藏期间硫代巴比妥酸含量变化Fig.2 TBARs contents of beef during storage

研究人员认为肉制品中硫代巴比妥酸值含量超过1.0 mg MDA/kg时会产生酸败的味道[9],但也有人员发现不同的结论,研究发现牛肉中TBARs值在(0.5～2.0)mg MDA/kg范围内都是可接受范围,在不超过2.0 mg MDA/kg范围内都是没有酸败气味的[10]。低温等离子体以氧气为诱导气体可产生大量的活性氧自由基,活性氧自由基的强氧化性可以迅速造成脂质的氧化,使贮藏前期TBARs值升高,在贮藏过程中包装盒中的氧气与部分脂质自由基反应引起邻近不饱和脂肪酸发生脱氢反应-脂质的链式反应,从而造成在贮藏过程中TBARs值的升高。相似的结果已有报道,MAP处理会造成牛肉储藏期间脂质氧化程度的提高,并且随着气体中 O2浓度的提高而提高[11]。也有部分研究发现,低温等离子体处理仅会造成牛肉在贮藏前期的脂质氧化(p＜0.05),随着贮藏的进行,低温等离子体处理和对照组差异不再显著[12],说明等离子体促进脂质氧化只是在短时间起作用,随着贮藏时间延长,促进作用减弱,这与等离子体中的活性成分寿命短有关系。

2.3 挥发性盐基氮含量的变化

图3 贮藏过程中牛肉挥发性盐基氮含量变化Fig.3 TVB-N contents of beef during storage

TVB-N是指蛋白质在微生物分解作用下产生的碱性含氮物质与有机酸反应的结合产物,主要包括氨、二甲胺和三甲胺等。肉制品在贮藏过程中由于微生物的脱羧、脱氨基等作用,产生大量的游离氨基酸以及挥发性盐基氮等物质,从而造成肉品质的腐败、酸败。按照GB 2707—2005《鲜(冻)畜肉卫生标准》,鲜肉中挥发性盐基氮含量小于15 mg/100 g。对贮藏过程中牛肉的挥发性盐基氮含量进行测定见图3。随贮藏时间延长,各实验组牛肉的TVB-N含量增加显著(p＜0.05),等离子体处理组的TVB-N值一直低于MAP处理组,但差异不显著,到贮藏期第7天,两者之间的差异达到最大值(1.51 mg/100 g)。在贮藏期第10天,CPCS+MAP处理组与MAP处理组的TVB-N值分别达到为15.02 mg/100 g和15.16 mg/100 g,超过国标中的限量标准。TVB-N与微生物含量关系紧密,CPCS能杀死并抑制牛肉中微生物的生长繁殖,从而使得牛肉中TVB-N含量的下降。TVB-N为指标判定牛肉新鲜度的效果滞后于菌落总数,可能是因所测定的部分含氮化合物来源于微生物生长,微生物利用蛋白质等作为生长基质,生成带有异味的含硫化合物和胺类[13]。在贮藏期间,由于微生物受到低温等离子体的抑制生长缓慢,产生含氮物的速率相对较低。

2.4 贮藏期间牛肉生物胺含量的变化

将 0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 mol/L 的 8 种混合生物胺标准溶液依次进样,根据浓度和对应的峰面积制作标准曲线,得到生物胺标准溶液的回归方程。对贮藏过程中牛肉的生物胺含量进行测定见表3。

表3 贮藏期牛肉中生物胺的含量变化Tab.3 Biogenic amines contents of beef during storage mg/kg

由表3可知,原料肉中共检测到5种生物胺,其中精胺为牛肉中主要的生物胺,腐胺、组胺、亚精胺和苯乙胺的含量依次降低。在贮藏过程中,精胺的含量始终高于另外4种生物胺含量(p＜0.05)。精胺是天然存在于肉制品中的胺类物质,贮藏末期,精胺由于被微生物作为氮源利用[14],导致含量呈现显著下降(p＜0.05)。经等离子体处理的牛肉中精胺含量始终显著低于MAP处理组(p＜0.05),10 d后,处理组的精胺含量低于未处理组4.37 mg/kg,表明低温等离子体处理有效抑制牛肉中精胺含量增加。

腐胺含量仅次于精胺,随贮藏时间延长,其含量显著增加(p＜0.05),等离子体处理组牛肉腐胺含量显著低于未处理组(p＜0.05),第4天时,处理组牛肉中腐胺含量低于MAP处理组1.16 mg/kg,两组间的差异最大,之后两组间的差异逐渐减少,表明低温等离子体处理对牛肉中腐胺含量的抑制作用随着贮藏时间延长而逐渐减弱。腐胺自身的毒性强弱受关注度相对低,而其对组胺毒性的增强作用受到广泛关注,因其对组胺代谢酶活性具有明显抑制作用[15]。此外,腐胺可以与亚硝酸盐反应,作为亚硝胺形成的底物,有利于亚硝胺含量增加。

组胺含量随着贮藏时间的延长呈现先增加后降低的趋势。低温等离子体处理组样品中组胺含量始终低于MAP处理组,在4d时,两组样品间的差异最大。在贮藏期第10天,等离子体处理组牛肉中的组胺含量与初始原料中含量相同,表明等离子体处理对组胺的形成具有很好的抑制作用。亚精胺含量非常低,在贮藏过程中CPCS+MAP组与MAP组差异不显著。贮藏结束,亚精胺含量是相同条件下5种生物胺含量最低的。

苯乙胺是原料肉中含量最低的生物胺类,其含量随着贮藏时间的延长而显著增加(p＜0.05)。苯乙胺含量随着贮藏时间延长而显著增加(p＜0.05),其变化规律与腐胺相同。苯乙胺是原料肉中含量最低的,而冷藏结束后,其含量超过同条件下亚精胺含量,表明低温等离子体对牛肉中苯乙胺的抑制作用低于对亚精胺的作用。

牛肉冷藏过程中生物胺的形成主要是由氨基酸通过脱羧反应而成,与此反应相关的氨基酸脱羧酶活性与肉中腐败微生物生长繁殖有关,例如乳酸菌、肠杆菌和假单胞菌的生长繁殖都可能会影响氨基酸脱羧酶的活性。有效的杀菌处理可以杀灭或者是抑制牛肉中微生物生长繁殖,通过抑制牛肉中微生物的生长繁殖,可以控制肉中生物胺的形成。本研究中低温等离子体可以有效抑制牛肉中微生物的生长繁殖,同时也抑制精胺、腐胺、组胺、亚精胺和苯乙胺的含量增加,表明低温等离子体处理对牛肉的安全性具有很好的维持作用。

3 结 论

新鲜牛肉气调包装后经过低温等离子体处理,在4℃条件下贮藏10 d。研究低温等离子体对贮藏过程中生鲜牛肉主要腐败菌、硫代巴比妥酸、挥发性盐基氮及生物胺的影响。在贮藏过程中低温等离子体处理组牛肉中菌落总数、假单胞菌、热杀索丝菌、乳酸菌、微球菌和肠杆菌的菌落含量均显著低于气调包装组。10 d后,低温等离子体处理组的菌落总数含量为5.76 lg(CFU/g),按照国标属于二级鲜度,此时而仅气调包装组牛肉中菌落总数含量超过国标要求,因此,低温等离子体处理可以有效延长牛肉的货架期。虽然低温等离子体处理造成牛肉中TBARs值的升高,但在(0～2)mg MDA/kg范围内,一般认为TBARs含量低于2 mg MDA/kg时未对产品的风味造成显著影响。进过等离子体处理可以有效降低贮藏期间牛肉中TVB-N含量,从而达到保鲜的目的。经低温等离子体处理的牛肉中各种生物胺含量都明显低于MAP处理组。本研究结果表明低温等离子体处理能够抑制牛肉中微生物生长繁殖,维持牛肉安全品质,因此,低温等离子体冷杀菌对牛肉保鲜包装中具有良好的应用前景。