酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断价值探讨

张福兴 曲靖市中医医院检验科 （云南 曲靖 655000）

内容提要： 目的：探讨酶联免疫斑点检测技术（Elispot）对结核性脑膜炎的诊断价值，为结核性脑膜炎临床诊断提供参考资料。方法：选取2012年5月～2015年9月在本院脑病科住院治疗的122例疑似结核性脑膜炎患者，根据最终治疗与随访结果，将所有患者分为观察组（结核性脑膜炎组）65例与对照组（非结核性脑膜炎）57例，均行Elispot检测脑脊液、外周血标本的检测阳性率。结果：观察组脑脊液、外周血标本阳性率均显著高于对照组（95.38%vs3.51%，83.08%vs0），经χ2检验差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：采用脑脊液和外周血Elispot检测用于结核性脑膜炎早期诊断有助于提高诊断阳性率，是一种比较理想的实验室检测方法。

结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由结核杆菌引起的一种非化脓性炎症性疾病，其发病率占神经系统结核的70%左右，近年来受结核杆菌基因突变、抗结核药物研究滞后等因素的影响，本病发病率与病死率呈逐年升高趋势[1]。治疗时间越早患者预后越好，许多结核性脑膜炎患者发病早期无典型症状，而且微生物学检查的阳性率较低，因此临床诊断难度较大。为此人们需要探索一种更加准确、可靠、便捷的诊断方法[2]。酶联免疫斑点检测技术（Enzymelinked im m unospotassay，Elispot）是从单细胞水平检测细胞因子或分泌抗体的新型检测技术，国外报道显示该技术的诊断敏感度在83%～97%之间，特异度则高达100.0%，我国作为结核病高发国家。

1.资料与方法

1.1 一般资料

本研究所选病例为2012年5月～2015年9月在本院脑病科住院治疗的122例疑似结核性脑膜炎患者，纳入标准：①为初治病例；②临床表现为发热、头痛、脑膜刺激征等，影像学表现为脑积水、基底节区渗出等，结合症状表现高度怀疑为结核性脑膜炎；③对本次研究目的及意义完全知情，并自愿签署知情协议书；排除标准：①合并肝肾功能受损；②入院前使用过免疫抑制剂或增强剂治疗；③临床资料不完整或中途退出、失访。根据所有患者的最终治疗与随访结果，将符合以下诊断标准者纳入结核性脑膜炎组：①腰椎穿刺和脑脊液（CSF）检查分歧杆菌培养阳性；②合并其他部位结核，有细菌学或病理学证据支持；③诊断性抗痨治疗有效，随访1年病情无反复。最终符合结核性脑膜炎的病例合计65例，分配至观察组，其他57例为非结核性脑膜炎，分配至对照组，经过对症治疗或抗痨以外其他治疗最终获得痊愈。观察组中有男性患者35例，女性患者30例，年龄13～69岁，平均（44.28±8.90）岁，对照组中有男性患者29例，女性患者28例，年龄15～66岁，平均（42.15±9.05）岁，两组患者性别及年龄分布基本相同，基线资料比较无显著性差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有患者均按照以下步骤行Elispot检测：1.2.1制备细胞工作液。采集脑脊液6mL，新鲜外周血8mL，注入含肝素抗凝剂的试管内，采用Elispot检测专用试剂盒并在二级生物安全柜内进行操作，加入适量细胞培养液混合离心10min，吸取中间层白细胞转移到15mL离心管中，加入无血清培养液调整细胞密度到0.1×106个/mL待检。

1.2.2 Elispot检测。每个待检标本均启用2个检测孔，分别加入靶向抗原，阴性对照孔加入不含抗原的细胞培养液，阳性对照孔内加植物血凝素，各孔加入预先制备好的细胞工作液，严格按照试剂盒说明书进行操作，最后进行斑点统计与结果判定。每一反应孔中斑点数减去阴性孔中斑点数为反应结果，结果≥40为阳性。

1.3 观察指标

将观察组与对照组的Elispot检测结果进行比较，统计各组脑脊液与Elispot检测阳性率，同时比较各项指标检测水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计数资料用构成比或率表示，以χ2检验，统计学检验水准设定为：α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

两组患者脑脊液与外周血Elispot检测结果对比。观察组与对照组脑脊液、外周血Elispot检测阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1. 两组患者脑脊液与外周血Elispot检测结果对比

3.讨论

结核性脑膜炎是一种临床常见感染性疾病，病因为结核杆菌感染，在肺外结核中有许多患者会累及神经系统，其中就以结核性脑膜炎最为常见[3]。近年来随着抗生素滥用的增多导致结核杆菌基因突变愈加严重，加之抗结核药物研制相对滞后，导致结核性脑膜炎发病率与患者死亡率持续攀升。据不完全统计，我国结核感染人数已超过5亿，其中结核性脑膜炎占6%甚至更高，而且大部分患者为凶险的Ⅱ期和Ⅲ期，预后普遍较差[4]。早发现、早诊断、早治疗是改善预后，降低病死率的关键，目前常用的实验室诊断方法中，涂片镜检阳性率不高，而且培养周期长，PCR法要求严格且假阳性率高，各种辅助手段缺乏特异性，难以实现精准、快速的早期诊断，容易增加临床治疗难度，造成颅脑不可逆损伤[5]。

人体感染结核杆菌后，巨噬细胞释放抗体，周围T淋巴细胞产生免疫应答释放多种淋巴因子，IFN-γ是抗结核杆菌感染免疫中的关键性细胞因子，Elispot检测即利用被结核杆菌致敏的免疫细胞诊断结核杆菌感染，计数具有分泌IFN-γ功能的T细胞数量。由于该低分子多肽只存在于结核杆菌基因RDI区，因此该方法的检测灵敏度与特异度均较高，可用于临床疗效观察的参考指标[6]。

综上所述，采用Elispot法检测结核杆菌效应T细胞在脑脊液或外周血中的表达水平，能够为结核性脑膜炎早期诊断提供重要的参考信息，但是本次研究中也体会到与外周血采集过程相比，脑脊液的采集相对困难，可能会影响阳性反应，这需要今后大样本数据的积累以及进一步研究证实。