结直肠癌人体肿瘤移植小鼠模型的研究进展

2018-08-08张家洧综述杨云柯审校

复旦学报(医学版) 2018年4期

张家洧(综述) 杨云柯(审校)

(复旦大学附属中山医院中西医结合科上海 200032)

结直肠癌是当今我国最常见的恶性肿瘤之一,其在所有恶性肿瘤中发病率与死亡率均为第5位,且呈现逐年上升的趋势[1]。虽然近年来结直肠癌的治疗水平不断提高,但对于发生转移的结直肠癌的治疗效果并不理想。肝脏是结直肠癌转移的主要器官,超过60%的结直肠癌患者死亡是由肝转移导致的[2-3],虽然新型化疗药物及靶向药物不断出现,但超过95%的新药在Ⅲ期临床试验研究中被证实对人体无效[4]。

影响Ⅲ期临床试验结果的一个重要因素是现阶段缺乏能精确反映药物疗效的临床前期模型。一般的动物模型不能模拟人体内肿瘤微环境内基质及免疫成分的功能和肿瘤的异质性[5],而有研究表明这些成分恰恰对肿瘤耐药[6-7]、侵袭[8]、转移[9]及复发[10-11]起着重要作用。随着生物技术的不断发展,出现了包括致癌物诱导模型(carcinogen-induced models)、基因工程鼠(genetically engineered mouse,GEM)模型及人体肿瘤移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)模型等复杂模型[12],可以较好地弥补上述不足。本文将对结直肠癌PDX小鼠模型构建及应用的最新进展进行综述。

3种主要的临床前期模型致癌物诱导模型使用电离辐射及化学药物诱发动物大肠癌,目前常用二甲肼和亚硝胺类化学物质[13-14],该方法简单、重复性强,短时间内可大量复制,并且可以基本模拟癌变过程,诱发分化较好的腺癌。但由于转移少见,且人癌发生原因复杂,并非都是由已知诱癌剂引起,所发生肿瘤的病理组织学类型及其发展与人肠癌不尽相同,且动物发癌先后不齐,所需时间较长;此外,实验中涉及环保问题,需要防护设施,对实验条件要求较高[15]。

基因工程模型利用转基因技术将肿瘤形成相关基因直接转入动物体内进行表达,使建立的肿瘤模型的致癌过程和病理表现更接近人体[16]。但通过基因敲除技术和转基因技术,并未能建立单纯自发和转移的小鼠结直肠癌模型,其病变大多发生在小肠。因此,目前转基因肠癌模型的相关研究主要集中在良性腺瘤模型的建立和观察[17]。

PDX模型是将手术中获得的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠,以精确模拟患者肿瘤的生物学特性[18-19]及不同患者间肿瘤的异质性[17,20]。近年来,有关结直肠癌PDX模型研究报道的数量不断增加。多项研究表明,结直肠癌PDX 模型在组织病理学、癌基因表达以及对药物的反应上,均可较好地复制原发肿瘤的生物学特点[21]。PDX 模型是目前公认的理想、精准的转化医学研究平台,在大肠癌治疗方面已经取得了初步的成果,但仍然面临许多问题,如不同肿瘤在PDX模型中成瘤率差异较大(21%～89%)[21-24]。

小鼠选择不同研究选用的小鼠各不相同,其中以裸鼠及NOD/SCID小鼠最为常见。裸鼠无胸腺,缺乏成熟T细胞,不产生细胞毒效应细胞,但裸鼠体内的自然杀伤(natural killer,NK)细胞、脾脏和淋巴结中含有的巨噬细胞和抗原呈递细胞以及B细胞和免疫球蛋白均有一定的排斥移植物的作用,其组织移植成瘤率较低(43%～77%)[25-29]。同时有研究表明,裸鼠体内存在的B细胞和NK细胞发挥了一定的基因筛选作用,使得原发肿瘤的某些异质性可能会在体内传代中丢失[20]。因此,目前裸鼠用于结直肠癌PDX模型构建已逐渐减少。

NOD/SCID小鼠是一种非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠,既有由于DNA修补基因缺陷而导致的T、B细胞发育缺陷,又有NOD小鼠所具有的NK 细胞活性下降、补体活性下降和巨噬细胞功能缺陷,更适合移植人体肿瘤标本,组织移植成瘤率较裸鼠更高(70%～100%)[21,27,30-32],现广泛用于结直肠癌PDX模型构建。

BALB/c裸鼠及SCID小鼠用于结直肠癌PDX模型也有报道,其组织移植成瘤率较裸鼠高(60%～100%)[22-23,32-33],但移植异种组织时受体内NK细胞、巨噬细胞等影响,仍会对其产生免疫反应,且研究报道较少,综合结果有待进一步证实。

近年来,关于NSG小鼠用于结直肠癌PDX模型构建的报道也不断增加。NSG小鼠具有以下特点:(1)缺乏T细胞、B细胞和NK细胞,同时树突状细胞和巨噬细胞功能减退;(2)缺乏补体活性,淋巴瘤的发病率非常低;(3)随着年龄增长也不会产生T淋巴细胞;(4)寿命长,对辐射敏感,对微生物病原菌敏感[34]。与NOD/SCID小鼠相比,NSG小鼠的人体细胞和组织移植成瘤率显著提高,同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织。但Chou等[22]报道,使用NSG小鼠构建结直肠癌PDX模型,组织移植成瘤率仅为58%,这可能是受到操作过程、小鼠生存环境及生存时间的影响。

Brown等[35]总结了结直肠癌PDX模型,对不同品系小鼠组织移植成瘤率进行了meta分析。结果显示NOD/SCID小鼠移植成瘤率最高,可达78%,其次为BALB/c裸鼠,达到67%,均高于裸鼠63%的移植成瘤率,且NOD/SCID小鼠与裸鼠的移植成瘤率差异有统计学意义(P<0.000 1,OR=3.3,95% CI:2.08～5.33)。这对结直肠癌PDX模型构建中小鼠品系的选择有着重要的意义。

移植方式及组织类型选择PDX模型建立主要有异位移植和原位移植2种。异位移植建立移植瘤模型可分为经皮下移植建模及肾被膜下移植建模。Rygaard和Poulsen在1969年最早发明了经皮下移植构建PDX模型的方式,具有制备流程简单、肿瘤大小易测量等优点,为大规模制备PDX模型的首选方案。皮下移植建模是将术中采集的肿瘤组织或处理后的单细胞悬液移植到裸鼠身体上与肿瘤原发部位不相关的部位。应用较多的是将肿瘤细胞接种于裸鼠皮下(腋部、背部、后肢等),因不影响动物活动而成为较常采用的移植部位[36]。该方法操作简便,是建立PDX模型的基本方法。有文献报道,皮下接种时近头侧成功率较高,这可能和近头侧血管多,能为肿瘤生长提供丰富营养有关[37]。但缺陷在于肿瘤细胞或组织移植后由于有基膜的阻挡,常常局部生长,几乎不会发生远处转移,难以模拟患者体内发生的肿瘤转移。这一结果与Day等[12]的研究结果相一致。肾被膜下血供比较丰富,适合肿瘤的生长,但对技术要求较高。

1982年研究者们改进了移植方式,开始进行原位移植,原位PDX模型是将术中采集的肿瘤组织或处理后的单细胞悬液移植到免疫缺陷动物的相同原发部位或相关的转移部位。该模型的制备需要熟练掌握外科手术技巧。有研究表明,原位PDX模型荷瘤表现出较强的侵袭及转移特性。Puig等[31]通过PET和体外组织学检测证实66例原位移植瘤中13例(19.7%)发生远处转移,且多数为肝肺转移。该模型与原发肿瘤有最大的相似性,但成瘤率低,建模困难[38]。Puig等[31]报道在NOD/SCID小鼠盲肠壁注射1×106肿瘤单细胞悬液,移植成瘤率达88%。Julien等[28]报道在裸鼠盲肠壁黏膜移植50 mm3的肿瘤组织,移植成瘤率达64%。

各研究中移植的肿瘤组织块大小并不一致(1～27 mm3),但移植成瘤率与肿瘤组织块大小并无明显相关性:瘤块太大,早期血管生成的数量少,瘤组织易因供血不足而缺血坏死;瘤块太小则不易成瘤,从而降低成瘤率。因此,应根据不同的小鼠模型在免疫缺陷程度、操作要求和生存环境等方面的实际需要选择结直肠癌PDX模型构建时肿瘤组织块大小。

对于移植组织应来源于肿瘤原发灶还是转移灶,研究结果显示两者在移植成瘤率方面并无差异。这一结果也在Brown等[35]的报道中得到证实(P=0.37,OR=0.74,95% CI:0.39～1.4)。这种现象与非小细胞肺癌[39]及黑色素瘤[40]中观察到的移植组织来源于转移灶组织则移植成瘤率更高的现象并不一致。但Puig等[31]报道,转移灶来源的移植组织较原发灶来源的移植组织有更短的成瘤潜伏期[(46.6±21.7)天vs. (68±34)天],同时还发现分化程度高的移植组织较分化程度低的移植组织移植成瘤率更低。尽管尚未得到验证,但是肿瘤移植前的移植准备也是至关重要的。Linnebacher等[27]的研究显示,新鲜的移植组织与冷藏保存的移植组织在移植成瘤率方面并无差异(74%vs. 71%),但此现象有待于进一步的证实。

PDX模型的应用PDX小鼠模型很好地保留了人类肿瘤的基因组特征,还保存了原发性肿瘤大多数的关键基因和信号通路活性[41-42]。在一项包含原发性结肠癌、结肠癌淋巴结转移组织和肝转移组织各1例的结肠癌PDX模型研究中[22-23],比较父代(F0)和第3代(F3)的组织学特点,3组癌细胞在形态、排列方式、核分裂像及分化强度上极其相似。在基因水平的研究中,Guilhamon等[43]对6例结肠癌患者及其相对应的PDX模型的第1代肿瘤进行甲基化分析,发现仅有5个探针位点的改变,而且并未发现这些变化的位点有任何特殊功能。Chou等[22]对27例结肠癌PDX模型转录水平的研究显示,随机选取的2个原位结肠癌PDX子代及其相应的父代转录类似度分别为0.858和0.942;而其对应的F1和F2的转录相似度更是高达0.985和0.988。就生长方式而言,部分PDX小鼠模型会出现自发转移至其他器官(如肺、骨及腹膜等),这些都与患者的临床表现相似[44]。此外,PDX模型在早期阶段保持了患者肿瘤的基质成分及肿瘤微环境,可以用于研究肿瘤微环境及其对肿瘤的影响[45]。PDX模型在模拟患者体内肿瘤的生长模式的基础上还可以保留肿瘤细胞基因组学、转录组学、蛋白质组学及关键信号通路特点,应用范围也越来越广,这也是近期PDX小鼠模型的应用呈指数增长的主要原因[46]。目前,PDX模型主要有以下几种应用:

首先,通过PDX模型可以发现新的肿瘤生物标志物或新的作用靶点并进行验证,这可以为肿瘤患者个体化治疗提供可靠的依据。例如,利用Kras突变的结肠癌细胞株和PDX模型发现AZD6244 (MEK抑制剂) 发生耐药的标志物是Wnt通路活化,由此认为可以联合靶向Wnt和MEK通路达到抗肿瘤的效果[46]。新的肿瘤生物标志物和治疗靶点的发现对于促进临床-基础之间的转化研究、整合下一代测序寻找新靶点和确定PDX小鼠模型的基因组学特点有着非凡意义,并对依据肿瘤分子分型制定个体化治疗方案有一定的促进作用[47]。其次,PDX模型也可以被应用于筛选临床药物及预测抗肿瘤药物疗效。研究显示PDX小鼠模型和肿瘤患者在药物使用前后的疗效上存在着相似性,表明PDX模型具有一定的预测价值[19,42]。例如,在EGFR抗体西妥昔单抗治疗大肠癌时,PDX小鼠模型与患者表现出的反应率相似[21,28]。Fichtner等[25]对15 个大肠癌PDX模型进行化疗研究,在化疗过程中5个伴肝转移的PDX 模型显示的药物敏感和耐药反应与患者的临床反应有高度的相似性:其中1例患者在接受5-氟尿嘧啶作为新辅助治疗后进行了肝脏和直肠切除术,但5个月后发生肝转移,在奥沙利铂、伊立替康联合治疗下,病情得到有效控制。在相对应的PDX模型中显示对奥沙利铂、伊立替康反应较好,而对5-氟尿嘧啶耐药;另1例患者在对5-氟尿嘧啶不敏感的情况下改用奥沙利铂、伊立替康联合治疗后,肿瘤标志物CEA的水平显著降低,肝转移灶也明显缩小,相应的PDX模型对奥沙利铂、伊立替康的敏感性较好,对5-氟尿嘧啶表现出耐药;还有2例用5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸进行化疗的患者,在表现出短暂的反应后也对5-氟尿嘧啶系统化治疗出现耐药,相应的PDX模型对5-氟尿嘧啶表现出临界反应(T/C=50%)。在这一PDX 模型验证药物有效率的研究中,5-氟尿嘧啶的有效率为33%(5/15)、伊立替康和奥沙利铂的有效率分别为100%(15/15)和57%(8/14),这与相应患者的临床有效率相一致。使用PDX小鼠模型的联合临床试验可以迅速提高患者分层、认识耐药机制、优化药物组合和测定生物标志物。

构建PDX模型面临的挑战虽然PDX小鼠模型在筛选个体化用药方面取得了一定的成就,但是仍然需要更多的研究去攻克PDX小鼠模型存在的不足和缺陷。

构建PDX 模型时,会出现人源性间质成分在PDX肿瘤组织中丢失的情况,或者在PDX模型体内移植人源性非淋巴瘤肿瘤组织容易形成人源性淋巴瘤等问题[35,44]。对于人源性间质成分在PDX小鼠模型体内的肿瘤组织丢失这个问题,研究者们认为这一发生于基因表达层面上的问题可能是因为人源性分子探针不能检测出免疫缺陷小鼠体内鼠源性基质的相似物[22,28]。大多数在PDX小鼠模型体内形成的淋巴瘤常常都是表达人CD45的人源性B细胞型淋巴瘤,且与Epstein-Barr (EB)病毒感染密切相关[48-49]。推测淋巴瘤形成的原因可能在于免疫缺陷的小鼠体内没有免疫监视,受EBV感染后的B淋巴细胞经移植后变换成为增殖状态[48]。此外,在PDX小鼠模型中,亲代肿瘤的炎症与人源性淋巴瘤的发生比例呈正相关,比如胃癌模型淋巴瘤发生率比大肠癌模型高,就是由于胃癌有较高的基线炎症率[48]。因此,成功制备PDX小鼠模型需要对生长出来的肿瘤组织进行表型复检。

其次,肿瘤组织在模型中不生长而导致PDX建模失败;不同的肿瘤组织类型定植效率也存在非常显著的差异;而且由于诸多原因,要想制定出符合临床需求的标准操作程序存在一定的难度。尽管PDX小鼠模型在基因组学等方面与亲代肿瘤接近,但还是不能完全反映患者的肿瘤信息,PDX小鼠模型中的肿瘤可能发生遗传、病理组织和微环境的改变、不同的免疫缺陷小鼠品系会产生不同的实验结果、PDX小鼠模型中的肿瘤只能反映活检取材时患者的肿瘤情况。而肿瘤是不停进化的疾病,进化后的肿瘤对PDX小鼠模型上筛选出的药物可能会发生不同的反应效果。因此,即使成功建立PDX小鼠模型,也不能真实反映患者的肿瘤情况;进行皮下或者原位移植时,肿瘤微环境的真实情况也未必能得到准确反映;一些在患者身上发生转移的肿瘤在PDX小鼠模型中未必都会发生转移。所以这种情况下的研究结果很难用于指导临床患者的肿瘤治疗;此外,制备和维持PDX小鼠模型常常需要大量经费,增加患者负担,且制备PDX小鼠模型也需要较长的等待时间,一些较重的患者可能尚未等到实验结果出来就已经死亡。

结语虽然实验动物及移植组织类型及方式的选择对结直肠癌PDX模型的构建有非常重要的影响,但如上所述仍有诸多因素影响其移植成瘤率(表1),并且对操作技术要求较高,从手术室获取标本后需要外科医师、组织学家和研究者密切配合;同时,由于患者来源的肿瘤组织数量有限,使用上受到医学伦理道德的限制,造成已有的原代模型数量少。即使在移植瘤形成后,传代的样本需进行组织病理学检测,以确定其与原始样本的一致性。这些问题都有待于进一步研究。