lncRNA基因At3NC026490启动子克隆与功能分析

岳少康，谢 鑫，陈 滢，李绪彦，边少敏

（吉林大学植物科学学院，吉林 长春 130062）

在真核生物中90%的基因组可以转录，大部分转录为非编码RNA （ncRNAs），其中长度大于200 nt、无编码蛋白能力的RNA被称为长链非编码RNA （long noncoding RNA，lncRNAs）。近年研究表明，lncRNAs在真核生物中种类丰富且分布广泛，能够在表观遗传、转录及转录后水平调控基因的表达或直接影响蛋白功能［1-3］，因此作为一个“明星分子”开始受到广泛关注。根据文献检索结果，目前NCBI的PubMed数据库中至少收录了20多个植物物种lncRNA的报道，每个物种中都有大量的lncRNAs得到鉴定。随着lncRNA功能缺失与获得突变体的应用，人们对其中少量lncRNAs的生物学功能有了一定认识，主要集中在以下方面：调控植物开花的过程［4-5］，参与植物有性生殖的调控［6］，在光形态建成中扮演重要角色［7］，参与根发育调控［8］，调控种子萌发过程［9］，参与共生固氮根瘤形成的调控［10］，在植物磷代谢平衡中发挥重要作用［11］，在次生代谢物质合成过程中发挥重要作用［12］，参与外界胁迫的应答调控［13］。然而相对于动物而言，目前关于植物lncRNA功能的研究还处于初步阶段。

拟南芥是展开科学研究的模式植物，其相关研究成果为研究其他植物尤其是双子叶植物提供了重要的理论参考。目前在拟南芥中发现 40 000 多个 lncRNAs［14-15］，仅对COOLAIR、COLDAIR、HID1、APOLO、AsDOG1、At4NC069370等少数几个lncRNA的功能进行了研究，如COOLAIR通过影响FLC的表达从而调控植物开花［4-5］；Wang等［7］报道 HID1 通过其靶标基因PIF3介导红光下植物形态建成的调控，APOLO通过作用其靶标记忆基因PID从而调控出生根的发育［8］；Fedak 等［9］研究表明asDOG1能够抑制种子成熟过程中DOG1基因的表达，而asDOG1是调控种子萌发的重要因子。对于其余大量的lncRNAs，它们是转录“噪音”还是功能分子？如果是功能分子，它们参与哪些生物学过程？这些问题都有待于阐释。

启动子通常是位于基因上游起始转录的一段DNA序列，是调控基因表达的指挥棒，它不仅能够调控基因表达的水平而且决定基因表达的部位和方式［16-17］。因此研究基因启动子特性对于揭示基因在植物生长发育或响应胁迫过程中的生物学功能具有重要意义。At3NC026490是拟南芥中的一个lncRNA，目前尚未见到关于其功能方面的报道。本研究克隆了At3NCC026490的启动子，并通过生物信息学手段对该启动子的特性进行分析，进一步通过启动子驱动GUS基因表达的策略对该启动子的功能进行分析，以期为研究At3NC026490的生物学功能提供重要的信息和研究思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将Col-1野生型及转基因拟南芥种子在4℃黑暗环境下春化3 d，播于蛭石与草炭以1∶3比例混合的基质中，然后在22℃、16 h/8 h（光照/黑暗）条件下培养。

1.2 试验方法

1.2.1 拟南芥基因组DNA提取 采集Col-1野生型拟南芥叶片，液氮速冻后研磨成粉状，然后利用CTAB法提取基因组DNA。

1.2.2 拟南芥At3NC026490基因启动子克隆 在TAIR网站（www.arabidopsis.org）中获取At3NC026490基因上游1 072 bp的DNA序列，并设计带有Gateway接头的引物At3NC026490-Pro-F（ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctCTTATGTTG ACTATGGGCCTGGTTT）和At3NC026490-Pro-R（ggggaccactttgtacaagaaagctgggtTTAGCGGTTGGCA CCAATCATAG）。以拟南芥基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeStar（TaKaRa）进行PCR 扩增：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸7 min。PCR产物根据天根公司的普通琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）说明书进行回收。

1.2.3 启动子区域驱动的GUS表达载体构建 利用B P反应将P C R产物重组到pDONR207载体中，然后转化至DH5α感受态细胞，进行涂板筛选，挑取阳性单菌落于37℃摇菌培养，提取质粒并测序。选取序列正确的质粒，利用LR反应将启动子序列构建到目标载体pMDC162中，最后将成功构建好的pMDC162-At3NC026490-Pro质粒转入农杆菌GV3101。

1.2.4 拟南芥的遗传转化及转基因阳性苗的筛选 利用蘸花侵染法将At3NC026490基因的启动子转入拟南芥中。T0代种子经次氯酸钠消毒后播种于含有50 μg/mL潮霉素的MS培养基中，生长10 d后，将依然保持绿色的植株转移到土壤中生长；待T1代转基因苗长到30 d后，采集叶片，按照1.2.1方法提取DNA，然后以启动子序列设计正向引物、以GUS基因序列设计反向引物，通过PCR检测上述利用抗生素筛选到的阳性苗是否存在目的基因，以确定幼苗为阳性转基因植株，繁殖转基因拟南芥直至筛选到T3代纯合体。

1.2.5 GUS染色 选取2个At3NC026490启动子转基因株系，采集莲座叶、茎生叶、花以及不同发育时期的果荚与种子（花后4、7、12、17 d），同时将转基因种子播种于MS培养基中，收集14 d的幼苗。将不同的组织及幼苗按照Tang等［19］的方法染色：将样品放入配好的X-Gluc solution染色液中，真空抽气15 min后置于37℃条件下16 h，然后利用70%的乙醇脱色。最后，利用倒置显微镜拍照。

1.2.6 生物信息学分析 利用TSSP在线软件（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=-programs&subgroup=promoter）预测At3NC026490 的转录起始位点；利用在线软件PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 对启动子的顺式作用元件进行分析和功能预测。

2 结果与分析

2.1 At3NC026490启动子序列及作用元件分析

At3NC026490基因位于第3条染色体上，其上游1 004 bp处为另一个lncRNA基因（At3NC026500），它们的转录方向相同（图1）。因此我们提取 At3NC026490与At3NC026500之间的DNA序列并利用TSSP在线软件进行TSS位点预测，结果显示在At3NC026490基因上游600 bp处有1个TSS位点。随后利用PlantCARE网站对该段序列进行启动子作用元件分析及功能预测，结果（图2，彩插一）显示，该序列具有典型的核心启动子元件，包含29个TATA-box和21个CAAT-box，其中CAAT-box决定启动子起始转录的效率及频率，可增强启动子的强度；TATA-box具有定位转录起始点的功能，说明该序列具有启动子的基本特点。除启动子基本元件外，该序列还具有多种转录调控相关的作用元件，包括11种光响应元件，生长素（TGA-element）、水杨酸（TCA-element）、乙烯（ERE）等响应元件，热响应元件（HSE）、逆境响应元件（TC-rich repeats） 等，暗示该启动子可能在响应光、激素、逆境胁迫等过程中发挥作用（表1）。此外，该序列还含有一些特殊的响应元件，比如在负义链150 nt处存在胚乳表达调控的skn-1_motif元件，在正义链953 nt处有1个CCAAT-box （MYBHv1结合位点）。

图1 At3NC026490及其两侧基因的分布

2.2 At3NC026490启动子的克隆

以拟南芥基因组D N A为模板，利用Gataway技术对At3NC026490基因上游1 072 bp的序列进行克隆，结果见图3A（彩插一），克隆片段大小为1 130 bp（Gateway接头共58 nt），进一步测序表明所克隆片段序列与At3NC026490上游序列一致（图3B，彩插一），说明克隆的基因组片段正确。利用gateway系统的pMDC162构建At3NC026490启动子驱动GUS基因载体（pAt3NC026490∶∶GUS），转化至农杆菌中，农杆菌菌落PCR检测结果见图3C（彩插一）。然后转入到野生型拟南芥中，通过潮霉素B筛选获得植株阳性苗（图3D，彩插一），T1代种子继续筛选，进一步繁殖后获取T3代种子后用于GUS染色分析。

表1 At3NC026490基因启动子顺式作用元件

2.3 At3NC026490启动子功能分析

为了更好地理解At3NC026490在植物各组织的表达情况，我们挑选2个株系（pAt3NC026490∶∶GUS 2与 pAt3NC026490∶∶GUS 4），对转基因植株的营养生长组织（根、幼苗、莲座叶与茎生叶）与生殖生长组织（花、果荚及种子）进行GUS染色分析。结果表明，在At3NC026490启动子的驱动下，GUS在拟南芥营养组织中的表达量均很高。由图4（彩插一）可知，2个转基因株系的莲座叶、茎生叶以及幼苗与根中出现明显的GUS表型，说明启动子能驱动GUS在这些营养组织中表达。比较而言，生殖生长组织较少受该启动子的影响，只在花瓣与果荚中观察到一定的GUS表型，而在其他花器官和种子中却没有出现GUS表型。种子发育是一个重要的动态过程，为了进一步研究At3NC026490启动子是否在种子整个发育与成熟过程发挥作用，我们对不同发育时期的果荚与种子（4、7、12、17 d）进行GUS染色分析，结果见图5（彩插一），尽管在果荚中GUS基因的表达量一直很高，但是在种子整个发育过程中没有观察到GUS表型，即GUS在种子发育与成熟过程中并没有表达，说明At3NC026490可能并不参与种子的发育与成熟过程。

生物信息学预测At3NC026490启动子含有多个光响应作用元件，我们对转基因株系进行8、16、24 h不同光照时间处理，然后观察14 d幼苗GUS表型的变化，结果（图6，彩插一）显示，8、16、24 h不同光照时间处理下幼苗中GUS表型并无明显变化，说明在幼苗中At3NC026490启动子对长短日照具有相似的响应。

3 讨论

lncRNAs在真核生物中种类丰富且分布广泛，能够在表观遗传、转录及转录后水平调控基因的表达或直接影响蛋白功能［1-3］。尽管在植物中鉴定了大量的lncRNAs，然而对其功能却了解甚少。At3NC026490是位于拟南芥第3条染色体上的一个lncRNA，目前尚未见到关于其功能方面的报道。本研究从启动子的角度阐释At3NC026490的功能特性，为揭示At3NC026490的生物学功能提供了重要信息和研究思路。

启动子是位于基因上游启动基因表达的序列，目前关于lncRNA基因启动子的研究还鲜有报道，因此确定At3NC026490启动子序列是一个关键环节。本研究从3个方面确定该启动子的序列：一是利用生物信息学手段预测到了TSS位点；二是该序列中含有启动子的核心元件CAAT-box和TAAT-box；三是利用该序列驱动GUS基因，可以在转基因拟南芥中观察到明显的GUS表型，结果表明本研究所克隆的序列确实具有启动子的功能。

启动子不仅能够调控基因表达的水平而且决定基因表达的部位和方式，研究基因启动子的特性是揭示基因生物学功能的一条有效途径。本研究中，我们通过两种方式阐释lncRNA启动子的特性，一方面利用生物信息学手段预测该启动子中含有响应光、激素以及胁迫的多种元件，这与许多lncRNA的表达受外界环境调控的报道相一致［19-20］，表明At3NC026490可能在响应激素及外界刺激过程中扮演着重要角色；另一方面，通过启动子驱动GUS基因联合GUS染色的策略研究该启动子的特性，结果表明营养组织中GUS表型明显，而在生殖生长组织中表型不明显，这与lncRNA具有组织表达特异性的报道一致［21-24］，说明At3NC026490可能在营养生长过程中发挥着重要作用。有趣的是在整个种子发育过程并未观察到GUS表型，至少有2个原因导致这种可能性：该启动子（至少是我们克隆的启动子）可能并不响应种子的发育与成熟，本研究克隆的At3NC026490启动子没有包括响应种子发育与成熟的元件。后续研究将检测At3NC026490在种子中的表达情况以确定At3NC026490启动子是否真正响应种子发育过程。

本研究克隆的启动子并未响应种子发育过程，这在提高转基因食品安全方面可能具有良好的应用前景。后续研究可利用该启动子驱动目标基因在待改良的作物中表达，由于该启动子可以响应营养生长，可以实现对营养生长以及抗性等性状的改良，同时保证目标基因及其融合的筛选标记基因在种子中不表达，从而提高食品的安全性。