不同培养基对蝴蝶兰杂交种子无菌播种生长的影响

陈春满，张善信，范俊强，罗耿周

（东莞市生物技术研究所，广东 东莞 523086）

蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）是著名的兰花品种，原产于亚洲热带地区，从喜马拉亚山到澳洲北部均有分布。其花型、花色丰富多彩，花朵数多，开花期长，深受国内外消费者喜爱，被誉为“兰花皇后”。蝴蝶兰可通过人工调控花期于春节前开放，极大满足了国内年宵花的市场需求。随着种植面积和产销量的急速增加，我国蝴蝶兰产业得到跨越式发展，大陆已逐渐成为全球蝴蝶兰种苗供应中心。

蝴蝶兰种质资源丰富，通过人工杂交可培育出新品种。我国台湾地区的蝴蝶兰育种走在世界前列，我国大陆于20世纪90年代也开始进行蝴蝶兰新品种选育工作，已陆续不断有新品种问市［1-5］。在新品种培育过程中，播种是很关键的一步，不同的品种杂交、不同的试验方法均会影响到小苗的出苗率。余慧琳等［6］、田甜［7］认为基本培养基影响蝴蝶兰杂交种子的萌发，徐晓薇等［8-10］认为椰子水有利于蝴蝶兰种子的萌发。为此我们设计了不同的方案进行播种试验，以探索出蝴蝶兰不同杂交种子萌发、分化、壮苗及生根的最有利因子，为蝴蝶兰杂交育种的长足发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杂交用的大花型母本植株大辣椒和红太阳从广州花之美园艺公司引进，小花型母本植株小深红、白唇、小白兔和红钻从福建漳州钜宝生物科技有限公司引进。参试的8个杂交组合分别为：1号：大辣椒（♀）× 白唇（♂）；2号：白唇（♀）×大辣椒（♂）；3号：红钻自交；4号：小白兔（♀）×大辣椒（♂）；5号：大辣椒自交；6号：红钻（♀）×大辣椒（♂）；7号：大辣椒（♀）×红太阳（♂）；8号：小深红（♀）×大辣椒（♂）。其中，1～3号授粉后4个月采摘其杂交果荚进行播种，用于观察种子萌发；2号和4～6号的种芽用于观察基本培养基对芽分化生长的影响；1～8号用于观察有机附加物对芽分化生长的影响，种芽为种子萌发后40～50 d、直径大小0.2～0.3 cm的胚性芽；1号和3～4号杂交种子生长形成的小苗用于观察其在壮苗和生根阶段的生长情况，每株小苗具有两片0.5～1.0 cm的小叶，无根。

1.2 试验方法

1.2.1 果荚处理 授粉后4个月的成熟蝴蝶兰杂交果荚经自来水冲选干净，用75%酒精表面消毒1 min，灭菌水冲洗1次，在无菌超净台上用0.1%升汞灭菌8 min，再用灭菌水冲洗3次后取出。在无菌碟上，用解剖刀纵向切开果荚，将粉状种子轻轻夹出，撒播在无菌的诱导萌发培养基上，每个果荚的粉状种子可均匀撒播在5～6瓶培养基上。

1.2.2 不同培养基对蝴蝶兰杂交种子萌发的影响 测定种子萌发的培养基共6个：处理1：MS+椰子水100 mL/L、处理2：1/2MS+椰子水100 mL/L、处理3：1/3MS+椰子水100 mL/L、处理4：1/4MS+椰子水100 mL/L、处理5：1/2MS+马铃薯汁100 g/L、处理6：1/2MS+苹果汁10 g/L。每个处理均添加2.5%白糖、琼脂6 g/L，pH调节至5.6～5.8，下同。试验在恒温恒光条件下进行，培养温度25～28℃，光照强度2 000～2 500 lx、光照时间12 h/d。1～3号蝴蝶兰杂交种子均分为6份，每个处理接种1份，每份接种1瓶，5次重复，播种后40 d统计不同处理每瓶种子萌发数量，取平均值。

1.2.3 不同基本培养基对蝴蝶兰杂交种子芽分化生长的影响 以萌发后的胚性芽为试材，以MS、1/2MS、1/3MS为基本培养基，分别添加马铃薯汁150 g/L，观察3个基本培养基对2号、4号、5号、6号4个杂交种子芽分化生长的影响。每个处理接种10瓶，40 d后观察记录鲜重增加值。

1.2.4 添加不同有机附加物对蝴蝶兰杂交种子芽分化生长的影响 以1/2MS为基本培养基，分别添加马铃薯汁0～150 g/L、椰子水0～100 mL/L、香蕉汁0～100 g/L，共9个处理（T1：1/2MS+马铃薯汁50 g/L、T2：1/2MS+马铃薯汁100 g/L、T3：1/2MS+马铃薯汁150 g/L、T4：1/2MS+椰子水100 mL/L、T5：1/2MS+椰子水100 mL/L+马铃薯汁100 g/L、T6：1/2MS+椰子水100 mL/L+马铃薯汁50 g/L、T7：1/2MS+香蕉汁50 g/L+马铃薯汁50 g/L、T8：1/2MS+香蕉汁100 g/L+马铃薯汁50 g/L、T9：1/2MS+香蕉汁100 g/L），每个处理10瓶，观察不同有机附加物对8个杂交种子芽分化生长的影响，40 d后记录每瓶鲜重增加值。

1.2.5 不同培养基对蝴蝶兰杂交种子组培苗壮苗和生根生长的影响 以1/2MS为基本培养基，分别添加马铃薯汁150 g/L、椰子水0～100 mL/L、香蕉汁0～100 g/L、白糖2.5%～3.0%，共6个处理（C1：1/2MS+马铃薯汁150 g/L+白糖2.5%、C2：1/2MS+马铃薯汁150 g/L+白糖3%、C3：1/2MS+香蕉汁25 g/L+马铃薯汁150 g/L+白糖2.5%、C4：1/2MS+香蕉汁50 g/L+马铃薯汁150 g/L+白糖2.5%、C5：1/2MS+香蕉汁100 g/L+马铃薯汁150 g/L+白糖2.5%、C6：1/2MS+马铃薯汁150 g/L+椰子水100 mL/L+白糖2.5%），观察其对1号、3号、4号3个杂交种子组培苗壮苗和生根生长的影响。每个处理接种10瓶，每瓶接种25株苗，培养前后称重，60 d后记录不同处理根、茎、叶鲜重，统计不同处理培养后茎叶、根及总鲜重的平均增长量。

1.3 数据统计方法

采用Excel整理数据，采用SPSS软件进行方差分析，LSD法进行多重比较和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对蝴蝶兰杂交种子萌发的影响

由图1可知，在以1/3 MS为基本培养基的处理3中，3个不同蝴蝶兰杂交组合种子萌发率高于以1/4 MS为基本培养基的处理4及以MS和1/2MS作基本培养基的处理1和处理2。处理3中的3个杂交种子均表现为萌发率较高、颗粒较大，散落在瓶子周围的颗粒均能发芽，处理4的萌发情况稍差于处理3，处理1最差，表现为不萌芽或种子萌发但死亡较多。表明一定的低盐浓度有利于蝴蝶兰种子萌发，过高或过低的盐浓度均不利于种子萌发。以1/2MS为基本培养基添加马铃薯汁100 g/L的处理6种子萌发率高、颗粒大、长势旺，表现最好；添加椰子水100 mL/L的处理次之，添加苹果汁10 g/L的处理最差，表现为萌芽率低、萌发后死亡现象多、无活力，表明不同有机附加物对蝴蝶兰种子萌发有较大影响（图2～图4，封二）。

图1 3个蝴蝶兰杂交种子在6种培养基的萌发比较

2.2 不同基本培养基对蝴蝶兰杂交种子芽分化生长的影响

不同基本培养基对蝴蝶兰杂交种子芽生长的影响如表1所示。以1/2MS为基本培养基的杂交种子芽表现为鲜重较重，除7号外，其他种子芽在1/2MS培养基中的鲜重均大于MS或1/3MS，表现为长叶长根较快、叶子大、芽多、长势好（图5，封二）。表明多数蝴蝶兰杂交种子在相同培养基处理中的表现类似，即过高盐浓度（MS）对蝴蝶兰杂交种子芽的分化和生长不利，过低盐浓度（1/3MS）养分不足，植株生长也不好。以1/2MS为基本培养基的处理其植株鲜重和长势均较好。不同杂交种子芽的分化速度不同，以6号分化效果较好，表现为鲜重较重；而7号种子芽的分化和生长能力较低，鲜重较轻。

表1 不同基本培养基对蝴蝶兰杂交种子芽鲜重（g）影响

2.3 添加不同有机附加物对蝴蝶兰杂交种子芽分化生长的影响

8个杂交种子胚性芽在添加不同有机附加物培养基中的表现如表2所示。从表2可以看出，以添加马铃薯汁150 g/L的T3处理的芽分化生长效果最好、平均芽鲜重为26.60 g，其次是T5、平均鲜重为19.32 g。只添加马铃薯汁50 g/L（T1）和香蕉汁100 g/L（T9）处理的芽生长较差，鲜重分别只有12.08、14.76 g。表明添加一定量的马铃薯汁有利于蝴蝶兰芽分化期的生长，表现为鲜重增加明显、叶片分化快、根茎叶较重。在相同培养基处理中，不同蝴蝶兰杂交种子芽生长情况不一致。8号杂交种子芽生长势最好，表现为平均鲜重最重、为29.97 g，其次是3号和6号，鲜重分别为23.86、21.34 g，而7号种子萌发后鲜重生长势最差，平均鲜重只有3.4 g，表明不同杂交种子芽在离体环境中适应程度不同。

表2 添加不同有机附加物对蝴蝶兰杂交种子芽鲜重（g）的影响

2.4 不同培养基对蝴蝶兰杂交种子组培苗壮苗和生根生长的影响

图6 不同培养基对1号蝴蝶兰杂交种子组培苗壮苗和生根生长的影响

图7 不同培养基对3号蝴蝶兰杂交种子组培苗壮苗和生根生长的影响

图8 不同培养基对4号蝴蝶兰杂交种子组培苗壮苗和生根生长的影响

从图6～图8可以看出，3个蝴蝶兰杂交种子在C5培养基中的组培苗总鲜重、根重和茎叶重的平均增长量显著优于其他处理，表现为叶子挺立、叶大而多、根系、长势好。表明不同杂交种在组培苗的壮苗和生根阶段对培养基的要求较为一致。但是不同杂交种的组培苗生长速度和整齐度不一致，3号种子组培苗生长势较好，在不同处理中均表现为长势好、整齐（图9，封二）。而1号种子苗在不同处理中的叶子长势均不佳。添加椰子水100 mL/L的C6培养基中组培苗表现为根少、叶片小，可见椰子水不利于组培苗的壮苗和生根。添加白糖浓度为3%的培养基中，除3号种子根系鲜重显著增加外，大部分组培苗的叶片鲜重和总鲜重增长没有显著增加，表明白糖适当减少对多数品种生长有利。

3 结论与讨论

本研究结果表明，不同蝴蝶兰杂交种子离体培养过程中，在种子萌发、芽分化和壮苗生根阶段，其生长表现不同，有些杂交种呈现萌发率高、芽分化和生长速度快、苗较壮实，而有些杂交种表现为适应性较差，萌发率较低、生长分化较为缓慢，这与魏翠华等［16］报道一致，可能与不同杂交种的基因型不同有关。

基本培养基对不同蝴蝶兰杂交种子的组培苗生长有较相似作用。在种子萌发阶段，以1/3MS为基本培养基的杂交种子萌发效果均较好，表现为萌发率高、颗粒大、长势好［11-16］。本试验结果表明，1/2MS优于MS和1/4MS，但1/3MS在不同的杂交组合中种子萌发情况更优于1/2MS，是对前人工作的一种补充。在芽的分化和壮苗阶段以1/2MS作为基本培养基，苗的生长效果较好，表现为鲜重较重、叶子分化较快、苗壮，表明种子在不同生长阶段需要不同的盐浓度比例。在萌发阶段需要更低的盐浓度，过高或过低的无机盐浓度均不利于种子萌发。在芽的分化和壮苗阶段，培养基中的盐浓度需要比种子萌发阶段提高一些，这可能是因为种子发育后期需要稍高浓度的营养元素。

有机附加物对不同杂交种子组培苗生长有较相似作用［18-21］。本试验结果表明，不同蝴蝶兰杂交种子在萌发和生长阶段，添加马铃薯汁比椰子水有更明显的促进作用。这与余慧琳等［6-9］的报道有所差异，他们认为椰子水更有利于蝴蝶兰种子的萌发，需要更进一步的验证。在芽分化阶段，马铃薯汁较高浓度（150 g/L）优于较低浓度（50 g/L）；在壮苗和生根阶段，较高浓度的马铃薯汁和香蕉汁具有明显的促进作用，表现为根茎叶生长明显，表明马铃薯汁在蝴蝶兰种子播种和组培生长过程中有重要作用，与杜云安［17］研究结论相符。这可能与马铃薯汁富含蛋白质、硫胺素、维生素C、维生素E、维生素A、磷、钾等［22］有关。添加香蕉汁利于组培苗后期生长，用量大作用更明显，也与杜云安［17］报道一致。

本试验中，蝴蝶兰种子从萌发到生根壮苗，均不需要加入外源激素，种子自身的激素已足以使其快速萌发和增殖。从生产角度考虑，如果要快速增加库存量，可以增加一定量的外源激素，如果作为杂交种后代的选育，我们认为不需要加入外源激素也可正常获得较大量的后代数量。