选择性激光熔化成型技术制备Ti6Al4V 对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响*

刘才辉 鄢荣曾 熊花平 万 娜 高 琪 何肖霞

钛及其合金材料现已被广泛应用于临床医学中，主要作为植入性材料用于人体的骨骼、组织、器官中。然而，在一系列的临床医学应用中逐渐发现，由于钛及其合金受其自身力学特性的影响，在其受力过程中会发生“应力屏蔽”现象，钛及其合金的弹性模量虽然较低，但仍高于人体的骨组织，因此容易造成植体的松动脱落[1]。针对这一问题，有学者提出以孔隙结构来改善钛及其合金的弹性模量，通过调节孔隙率达到与自然骨相近的力学性能，从而减弱或消除应力屏蔽的作用[2]。但目前的传统工艺成型技术难以满足植体的要求。选择性激光熔化技术(selective laser melting，SLM)是快速成型技术的最新发展形式之一，它利用计算机建立所需的CAD模型，设计出功能型结构，利用专业软件将模型转换成分层文件，导入3D打印成型设备，可以直接将金属粉末成型，并不受外型限制，制作出任何形态的植体。在口腔领域中，可以利用此技术对医用Ti6Al4V合金粉末进行熔融烧结，从而获得利于骨结合的粗糙表面，制作出牙冠内冠基台或植入体等个性化部件。同时，还可对钛合金植入体与骨接触的界面进行多孔化处理，以期血管及成骨细胞长入多孔结构内，促进植入体与骨的牢固结合，从而延长植入体的使用寿命。本文采用SLM成型技术制作Ti6Al4V试件，对其细胞毒性、细胞存活率、细胞凋亡率等方面进行生物学行为的综合评价。

1.材料与方法

1.1 试件的制备、分组及处理 采用SLM技术对Ti6Al4V粉末及纯钛粉末进行加工，分别制成直径15.5mm，厚度1mm的圆形Ti6Al4V试件和纯钛试件。将所有试件放入含丙酮的无水乙醇中超声清洗30min，分别在800目、1500目、2000目的砂纸上进行机械打磨，将其表面的氧化层、污垢层打磨干净后，依次放入100%丙酮中及100%乙醇中超声清洗30min，干燥消毒储存备用。

1.2 细胞毒性实验

1.2.1 比格犬骨髓间充质干细胞的培养 SPF级比格犬在3%戊巴比妥钠静脉麻醉下，行髂骨的骨髓穿刺，抽取骨髓组织10ml，离心15min，弃去上层脂肪及上清液后，将骨髓间充质干细胞进行重悬。将细胞悬液沿离心管壁缓慢加入含有Percoll细胞分离液的离心管中，离心25min，吸取离心后中间层呈云雾状的单核细胞层，加入放有培养液的离心管内，离心10min，弃去上清液，加入培养液3ml，后置于CO2孵箱内培养。待细胞增殖至培养瓶底65%-85%时，进行传代，以第3代或第4代细胞用于后续实验及胚胎来源鉴定。

1.2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 对骨髓间充质干细胞的成骨诱导，取第4代生长状态良好的骨髓间充质干细胞，加入成骨诱导剂(1.0×10-8mol/L地塞米松、60μg/mL维生素 C、6mmol/L β-甘油磷酸钠、含胎牛血清的DMEM培养液)，每3-4d更换诱导剂一次。于第21d终止培养，弃去器皿内液体，PBS反复并缓慢冲洗3遍。4%多聚甲醛常温下固定30min后PBS反复冲洗3遍，滴入茜素红染料，于37℃培养箱中15min后，吸去茜素红染料，PBS漂洗，拍照。

1.2.3 细胞相对增殖率及细胞毒性分级 将经过无菌处理的Ti6Al4V试件和纯钛试件置于24孔板底，取第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度至3×104/ml，制成细胞悬液，以每孔1ml从试件的上表面滴加悬液，接种于24孔板中。分为Ti6Al4V试件组、纯钛试件组，以含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液为空白对照组，每组8个复孔。细胞培养72h后，弃去原培养液，加入CCK-8溶液，继续培养3h后，以酶联免疫吸附仪在450nm波长下测量溶液吸光度值，计算各组试件的细胞相对增殖率(RGR)，公式为RGR=实验组A值/空白对照组A值×100%。根据细胞相对增殖率，确定细胞毒性分级[3]：0级为RGR≥100%，1级为75%＜RGR＜99%，2级为50%＜RGR＜74%，3级为25%＜RGR＜49%，4级为1%＜RGR＜24%。

1.2.4 细胞存活率的检测[4，5]将Ti6Al4V试件和纯钛试件置于24孔板底，取第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度至3×104/ml，制成细胞悬液，以每孔1ml从试件的上表面滴加悬液，接种于24孔板中。将放有Ti6Al4V试件和纯钛试件的孔板设为实验组，阴性对照组为加入100ml/L胎牛血清的DMEM培养液，每组8个复孔。复合培养72h后，以0.25%胰酶对试件上的细胞进行消化，将细胞置于离心管内离心，调整细胞浓度至1×106/ml。用4%浓度的Trypan Blue母液以0.01mol/l的PBS稀释至0.4%，45μl细胞悬液与5μl 0.4%Trypan Blue 混合后，37℃静置 3min，于已消毒的细胞计数板盖玻片的一侧加入细胞悬液，至溢满计数板，但不能过多。用10×物镜观察计数板四角大方格和中间方格的活细胞及死细胞数，以计上不计下、计左不计右原则，Trypan Blue会将坏死细胞染成蓝色。计数各组存活细胞以及总细胞并计算各组的细胞存活率。另取24孔板，将Ti6Al4V试件和纯钛试件置于24孔板底，取第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度至3×104/ml，制成细胞悬液，以每孔1ml从试件的上表面滴加悬液，接种于24孔板中。复合培养72h后，以0.25%胰酶对试件上的细胞进行消化，将细胞置于离心管内离心，调整细胞浓度至1×106/ml接种于6孔板中，接种24小时后弃去原培养液，PBS冲洗两次后，加入多聚甲醛固定15min后弃去，PBS冲洗两次，加入DAPI 1ml/孔，室温下避光10min后，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5 细胞凋亡检测——Annexin V/PI双染色法 将Ti6Al4V试件和纯钛试件置于24孔板底，取第4代生长状态良好的骨髓间充质干细胞，经胰酶消化后，应用含10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞浓度调整至5×105/ml，以每孔1ml从各试件的上表面滴加悬液，接种于24孔板中，每组设有8个复孔。将其置入CO2孵箱内共培养48h后，收集所有细胞，将细胞浓度调整为1×106/ml，以PBS离心2000rpm，5min，洗涤2次，加入500μL的Annexin V Bingding Buffer悬浮细胞，再加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidiumlodide混匀、避光下，染色30min，应用流式细胞仪以激发波长488nm、发射波长530nm检测各组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率。

1.3 统计方法 应用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计数资料以均数±标准差表示，计量资料以率表示，组间比较采用单因素三水平方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 骨髓间充质干细胞的培养及鉴定 骨髓间充质干细胞培养7d后，倒置显微镜下可见细胞呈梭形生长，分布均匀，3-4d即可融合，形态亦趋于一致，呈束状排列。对骨髓间充质干细胞施与成骨性诱导21d，经茜素红染色，可观察到有钙化结节形成，说明培育所得细胞具有形成骨的分化潜质(见图 1，图 2)。

图1 细胞传代后生长良好(×400 倍)

图2 细胞经茜素红染色，可观察到有钙化结节形成(×200 倍)

2.2 两组细胞毒性的比较 经过72h的复合培养，各组细胞增殖情况见表1。细胞相对增殖率Ti6Al4V试件组与空白对照组相比，无统计学差异(P＞0.05)，纯钛试件组与空白对照组相比，无统计学差异(P＞0.05)。且Ti6Al4V试件组与纯钛试件组之间细胞相对增殖率不存在统计学差异(P＞0.05)。两组的毒性分级均为1级，表明两种材料均无细胞毒性。

表1 两组细胞的相对增殖率及毒性分级(n=8,x±s，%)

两组细胞经过72h的复合培养，两组的细胞存活率都大于90%，尽管略低于对照组DMEM组，但Ti6Al4V试件组、纯钛试件组与DMEM组间无统计学差异(P＞0.05)，且实验组两组之间也无统计学差异(P＞0.05)，见表2，图3。

表2 Trypan Blue染色计算各组细胞存活率(n=8,x±s，%)

图3 各组细胞经Trypan Blue染色

2.3 各组材料对犬骨髓间充质干细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测了各组材料对犬骨髓间充质干细胞凋亡的影响。结果发现，各组材料与犬骨髓间充质干细胞共培养48h后，早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率及总凋亡率Ti6Al4V试件组、纯钛试件组均高于DMEM组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但Ti6Al4V试件组与纯钛试件组之间无统计学差异(P＞0.05)，见表3。

表3 各组材料浸提液对大鼠牙周膜细胞凋亡率的影响(n=8,%)

3.讨论

骨结合于20世纪60年代提出，它是指体内植体与骨相结合，是植体植入稳定的前提条件。骨结合受材料生物相容性、材料结构、材料表征等多方面的影响，其中，影响植体稳定性的主要因素便是材料的结构及材料的表征，同时，材料还应对细胞的粘附、增殖、细胞表型的表达有促进作用[6，7]。含钛材料为目前应用较广泛的生物材料之一，它具有质量轻、强度高等优良的物理特性。钛及钛合金现已被广泛应用到医学领域中，特别是在骨科疾病及口腔科领域中。

有研究表明，多孔材料有利于骨组织的长入，促进骨组织与多孔材料的连接，而且其多孔结构还可以影响细胞的增殖、分化、粘附及生长，有利于进一步的诱导成骨，此外，多孔结构增加的接触面积可以改变表型的表达，促进更多的成骨细胞分化[8，9]，以往多孔成型的方法主要为空间支撑技术、冷铸法、激光成型等方法。这些方法都存在一定的限制性，空间支撑法、冷铸法成孔较随机，激光成型法可控制一定的孔的分布、形态及大小[10]。但这些方法所制得的制件其机械性能与骨组织有较大差异，且其形态自由度受到很大限制，对于形状复杂的零件，不容易复制。3D打印技术，是快速成型技术的一种，它是在数字模型的基础上，通过计算机软件中的分层离散和数控成型技术，以激光束、电子束的形式将粉末状的金属或塑料粘合，逐层堆积[11]。目前，3D打印技术中比较成熟的分支主要有SLM技术、EBM电子束熔融(Electron Beaming Melting)等，其中SLM技术也是现今的研究热点。通过SLM激光烧结技术所制得的成品的强度要高于其他3D打印技术，它的加工速度很快，不需要支撑材料，材料的适用面广，精度高，可获得较高的形态自由度，基本可以制作出任意形状的制件，现已逐渐发展成为制作孔结构制件的较好选择之一[12]。但其也存在缺点，比如高温会破坏生物材料中的化学成分，粉末烧结出的表面略粗糙，不能打印细胞、生长因子等成分[13]。近些年来，研究者关于SLM成型制件对改善钛材料的生物相容性做了一定的研究。T.Habijan C.等研究证实，SLM成型技术存在制作钛镍合金多孔支架材料的可行性[14]。Johan，Blokhuis等应用SLM成型TC4材料制作特定尺寸下的制件，通过制得不同尺寸的钛合金支架，比较不同尺寸孔径下的成骨能力，结果证实多孔支架的成骨能力明显高于无孔支架的成骨能力，同时证实，孔径在150-500μm时，成骨能力最强[15，16]。作者经前期实验制得的Ti6Al4V合金材料的孔径约350μm左右，孔隙率约45%，基本符合Johan等人研究的材料成骨能力最强的范围。因此，本实验将此方法制得的Ti6Al4V合金材料与纯钛材料相比较，研究了骨髓间充质干细胞在两种材料上的生物学行为。

细胞粘附在含钛材料表面分为以下几个过程：血清蛋白吸附于钛材料的基底；细胞与钛材料的基底相连；细胞向钛材料中延伸[17]。对细胞毒性分级从大至小依次为：Ag+＞Au3+＞Cu2+＞Co2+＞Pd2+＞Cr3+＞In3+＞Sn2+[18]。本实验的体外细胞毒性实验结果观察到，骨髓间充质干细胞与Ti6Al4V合金及纯钛共培养72h后，细胞生长状态良好，表明两种材料对细胞的活力没有影响，不会对细胞的代谢或功能造成影响。本研究还发现，Ti6Al4V合金与纯钛的毒性等级均为1级，且纯钛及Ti6Al4V合金上骨髓间充质干细胞的细胞相对增殖率与空白对照组相比无统计学差异，说明两种材料均不会对组织及生物系统产生毒副作用或不良反应，且具有一定的抗炎作用，因此提高了其生物相容性。有研究报道，与Ti6Al4V合金相关的离子在体外会抑制骨髓基质细胞与成熟成骨细胞的正常分化[19]。但本实验研究结果显示，Ti6Al4V合金与纯钛上骨髓间充质干细胞生长状态均较良好，72h的细胞存活率两者间无明显差异。如果能够进一步提高Ti6Al4V合金的稳定程度，抑制离子的释放，将更有利于该合金的临床推广及应用。

细胞凋亡是一个极其复杂，且受多种基因影响的细胞死亡过程，它大致可以分为三个阶段：起始阶段、效应阶段、清除阶段。它属于可导致细胞发生解体的一系列分子级联反应，它需要将凋亡受体激活，将凋亡诱导因子活化，从而引起线粒体发生变化，当核酸内切酶被激活时，细胞即表现出凋亡特征，直至形成凋亡小体[20]。有研究人员表明，计算细胞总RNA量并结合细胞毒性实验、分子生物学实验等可以作为综合评价材料生物相容性的一个参考[21]。本实验中，将骨髓间充质干细胞与Ti6Al4V合金及纯钛合金共培养，48h后检测两组材料对细胞凋亡的影响，发现Ti6Al4V与纯钛的早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率及总凋亡率之间无统计学差异，但均高于DMEM组，说明Ti6Al4V与纯钛对细胞的凋亡均存在一定的影响，但两者之间对细胞凋亡的影响差异不大。

本文通过对Ti6Al4V合金与纯钛的体外生物学行为的研究，提示两种钛材料对细胞均无细胞毒性，无明显刺激性。均表现了较好的细胞存活率，两种材料间未见对细胞凋亡的差异，相容性良好。