棉花苗期耐低氮基因型初步筛选

贵会平，董强，张恒恒，王香茹，庞念厂，王准，刘记，郑苍松，付小琼，张西岭，宋美珍

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

氮是作物吸收的第一大必需营养元素，在棉花生长发育过程中具有重要的作用。而大量的施用氮肥和较低的氮肥利用率，在提高棉花产量的同时，也带来了生产成本增加、土壤资源退化及环境污染[1]等一系列农业生产及生态环境问题。我国是植棉大国，种质资源丰富，许多种质资源蕴含丰富的优良基因。因此，筛选耐低氮（氮高效）的棉花品种（系），分析棉花不同基因型氮素吸收利用的生物学特性及其生理生化机制，挖掘棉花自身吸收利用氮素的潜力，培育氮高效吸收利用的棉花品种，成为降低棉花氮肥用量、有效利用肥料资源、减少环境污染、提高植棉效益的重要途径之一，对棉花可持续发展具有重要意义。

目前关于小麦[2]、水稻[3]、玉米[4-5]氮高效的研究较多，在棉花上，科研人员针对不同栽培区域、熟性以及抗虫棉和非抗虫棉花品种，开展了氮素吸收和氮素利用效率的相关研究，对单株干物质、组织器官氮素分配、产量及氮高效相关基因进行了分析[6-12]。然而，陆地棉的基因组是复杂的异源四倍体，同源重复序列多，同一基因也具有多个拷贝；而且由于栽培区域广泛，不同品种（材料）间的生长发育特征各异，即使熟性类似的品种其表型及产量也差距很大。因此，以某一区域栽培品种开展小群体的品种筛选，势必存在局限性，即使获得氮高效材料未必是理想材料，基于此获得的候选基因也未必是最关键的氮高效候选基因。本研究在2个施氮水平下对选自三大棉区不同年代有代表性的270份棉花品种的主要农艺性状和氮吸收等相关性状进行综合分析，筛选耐低氮基因型，挖掘棉花自身吸收利用氮素的潜力，以期为氮高效品种的推广应用和培育提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

材料来源广泛，中棉、鲁棉、辽棉、冀棉、赣棉、湘棉、川棉、晋棉、豫棉、鄂棉、新陆早、新陆中、新海等270个棉花品种，由中国农业科学院棉花研究所种质资源库提供。

培养基质为沙，用自来水冲洗；测定养分含量：碱解氮 1.1 mg·kg－1，速效磷 1.9 mg·kg－1，速效钾 57 mg·kg－1。

1.2 试验设计

试验在中棉所海南大茅基地进行。设低氮N0（以氮计 0.01 g·kg－1），适氮 N1（0.1 g·kg－1）两个处理（肥料用量根据预试验确定），3次重复。肥料采用化学纯试剂，均于播种前施入。底肥为每千克河沙施用0.1 g P2O5（磷酸二氢钠）、0.1 g K2O（硫酸钾）、0.1 g镁肥（硫酸镁），氮肥用硝酸钙。每盆钵装风干河沙约4 kg，拌入100 g蛭石。因试验场地有限，筛选试验按照种子来源分四批进行 （每批种植中棉所20和中棉所27作为对照），每批培养30 d收获地上部及地下部。第一批（中棉所品种27个）于2016年3月30日播种，每盆留长势均匀的幼苗3株，适时定量浇水，观察棉花的生长状况，于4月29日收获。第二批（新陆早44个、新陆中19个，邯棉6个，豫棉7个，晋棉4个，辽棉7个，石早、夏早、百棉等，共计114个；其中87个品种由于离窗户近受干热风的影响，导致3个重复长势有差异，于第四批重种，27个品种长势未受影响，重复性好）于2016年5月2日播种，6月1日收获。第三批（辽棉、中植棉、冀棉、鄂抗、赣棉等 79个品种）于2016年6月4日播种，7月4日收获。第四批（陕棉、川棉、鲁棉、甘棉、新陆早、新陆中、邯棉等137个品种）于2016年7月7日播种，8月6日收获。

1.3 测定项目与方法

测定项目：SPAD值、根长 （子叶节处到根尖）、株高、叶面积（长×宽×0.81）[13]、地上部干物质质量、根干物质质量、氮积累量。生物量：鲜样在105℃杀青30 min，再在70℃下烘48 h，测定其干物质质量。氮积累量＝植株干物质质量×植株含氮量。氮含量用浓硫酸-过氧化氢消煮，凯氏定氮法测定[14]。以低氮和适氮条件下的相对比值来反映不同棉花品种氮效率的差异。

1.4 氮效率综合值计算

数据采用Excel和SPSS18.0统计分析软件处理。

2 结果与分析

2.1 两种供氮水平下棉花苗期农艺性状表现

由表1可知，供试品种适氮水平下7个农艺性状的平均值均显著高于低氮胁迫下的群体平均值，株高和氮积累量的均值在适氮水平达到低氮水平的2倍以上，这说明试验条件达到了预期效果，低氮对棉花产生了胁迫效应。7个农艺性状在不同供氮水平下变幅范围都较大，除SPAD值、低氮水平下第一批的根干物质质量和总干物质质量外（第一批都是中棉所系列，亲缘关系较近，根干物质质量、总干物质质量在低氮条件下变幅不大），变异系数都达到10以上，说明供试群体在所调查的性状上具有较为广泛的遗传差异性，这为耐低氮棉花株系的筛选提供了可能。

表1 两种氮水平下棉花苗期农艺性状表现Table 1 The agronomic traits of cotton seedlings under two nitrogen levels

表1 （续）

各筛选指标相对值的大小可以反映该指标受低氮胁迫影响的程度[16]。由表2可以看出，除SPAD相对值外，其他指标相对值变异系数较大，均达到10以上，说明这些性状对氮胁迫较敏感。第一批品种的SPAD、叶面积、根干物质质量相对值的最大值大于80%，第三批和第四批的SPAD、株高、根干物质质量、地上部干物质质量、总干物质质量相对值的最大值大于80%，这说明所选材料中存在低氮水平下长势良好即耐低氮品种。

2.2 棉花苗期各农艺性状相对值相关性分析

将两种氮水平下SPAD值、株高、叶面积、地上部干物质质量、根干物质质量、总干物质质量、氮积累量这7个指标的相对值进行相关性分析（表3），第一批的SPAD与叶面积极显著相关，与地上部干物质质量显著相关；株高与叶面积极显著相关，与地上部干物质质量、氮积累量显著相关；叶面积与地上部干物质质量、总干物质质量极显著相关，与氮积累量显著相关；地上部干物质质量与总干物质质量、氮积累量极显著相关；根干物质质量与总干物质质量极显著相关；总干物质质量和氮积累量极显著相关。第二批除SPAD与株高、根干物质质量没有显著相关性外，其他农艺性状间都有显著或极显著相关。第三批SPAD与株高、地上部干物质质量、根干物质质量、总干物质质量、氮积累量没有显著相关关系，其他性状间均有显著或极显著相关关系。第四批除SPAD与株高、叶面积，株高与叶面积，叶面积与地上部干物质质量、总干物质质量、氮积累量没有显著相关关系外，其他农艺性状间均显著或极显著相关，这说明这7个指标在反映棉花的氮高效能力上具有一致性，可作为筛选耐低氮棉花品种的指标。

表2 两种氮水平棉花苗期农艺性状相对值Table 2 The relative value of agronomic traits in cotton seedlings under two nitrogen levels

表3 两种氮水平棉花苗期农艺性状相对值相关性分析Table 3 The correlation analysis of the relative value of agronomic traits in cotton seedling stage

2.3 主成分分析法初筛棉花品种

任何单一指标都难以全面准确地反映作物品种耐低氮的强弱，应用多种指标来综合评价作物对低氮胁迫的适应能力较为科学。本研究采用主成分分析法将原来的7个指标转换成为2个或3个彼此独立的新指标，按其贡献率的大小赋予权重，既克服了单项指标的片面性，又克服了综合过程的主观性，使各品种的耐低氮得以量化。在此基础上，求出各品种的每一个综合指标值（第一、二、三批2个主成分CI(1)和CI(2)，第四批 3个主成分 CI(1)、CI(2)和 CI(3)）及相应的隶属函数值后，依据2个或3个综合指标的相对重要性（权重）进行加权，得到各品种耐低氮的综合评价值（D值）。

对两个氮水平下棉花品种苗期SPAD、株高、叶面积、地上部干物质质量、根干物质质量、总干物质质量、氮积累量7个性状的相对值进行主成分分析，取特征值大于1的因子，将原来7个单项指标转换为2个或3个新的相互独立的综合指标，求出各综合指标的系数、贡献率（表4）。第一批提取两个主成分，总解释方差为69.6%，主成分1由SPAD、株高、叶面积、地上部干物质质量、氮积累量决定，方差贡献率为51%；主成分2由根干物质质量和总干物质质量决定方差贡献率为19.6%。第二批提取两个主成分，总解释方差为83.7%，主成分1由株高、叶面积、地上部干物质质量、根干物质质量、总干物质质量决定，方差贡献率为71.7%；主成分2由SPAD值和氮积累量决定，方差贡献率为12.0%。第三批提取两个主成分，总解释方差为73.8%，主成分1由株高、叶面积、地上部干物质质量、根干物质质量、总干物质质量、氮积累量决定，方差贡献率为57.8%；主成分2由SPAD值决定，方差贡献率为16.0%。第四批提取3个主成分，总解释方差为87.9%，主成分1由株高、地上部干物质质量、总干物质质量、氮积累量决定，方差贡献率为57.9%；主成分2由SPAD值、根干物质质量决定，方差贡献率为14.7%；主成分3由叶面积决定，方差贡献率为14.3%。

表4 各综合指标的系数和贡献率Table 4 The coefficient and contribution rate of comprehensive index

根据各品种的综合指标值（CI）和贡献率，利用隶属函数公式计算氮效率综合值D（表5至表8）。由于试验是分批进行的，为了降低由于环境产生的误差，数据按批次分析。基于每批中综合表现（氮效率综合值D的大小）排序前10%（第一批和第二批品种较少，为避免剔出目标品种，选择综合得分排序前20%）的初步筛选为耐低氮品种，综合表现排序后10%（第一批和第二批选择综合得分排序后20%）的初步筛选为氮胁迫敏感品种。通过对第一批27个不同氮效率基因型棉花苗期沙培初筛试验结果分析，耐低氮型（综合值排序前20%）为中棉所35、中棉所69、中棉所14、中棉所49、中棉所45，氮胁迫敏感型（综合值排序后20%）为中棉所 64、中 662、中棉所 27、中棉所17、中棉所19。对第二批27份不同氮效率基因型棉花苗期沙培初筛试验结果分析，耐低氮型（综合值排序前20%）为豫棉12、新陆早12号、惠远717、新陆早23号、新陆早45号，氮胁迫敏感型（综合值排序后20%）为新陆中15号、新陆早53号、新陆中22号、新陆中17号、豫棉21。对第三批79份不同氮效率基因型棉花苗期沙培初筛试验结果分析，耐低氮型（综合值排序前10%）为银山4号、科林 098、沧198、光叶岱字棉、邯7860、岱红岱、泛棉3号、辽棉28号，氮胁迫敏感型（综合值排序后10%）为鸭鹏棉、国欣棉9号、赣棉 12号、宁棉 1号、珂字 201、赣棉 47、鄂岱棉、新植棉5号。对第四批137份不同氮效率基因型棉花苗期沙培初筛试验结果分析，耐低氮型（综合值排序前10%）为新陆早20号、邯667、邯686、石早 1 号、新陆早 42、石早 3 号、邯 656、新陆早25号、新陆早 39号、鲁棉2153、邯 2490、新陆早17号、川338、辽棉10号，氮胁迫敏感型（综合值排序后10%）为苏棉 22、运早N95、奥试棉4406、关农早 C-50、TM-1、鲁 05R59、国欣棉 11号、新棉33B、运早N177、岱字棉14号、春南保、新陆早9号、甘棉4号、军棉1号。

表5 第一批各品种综合得分D值Table 5 The first batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

表6 第二批各品种综合得分D值Table 6 The second batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

3 讨论

作物对氮吸收利用差异普遍存在[17-20]。利用不同棉花品种基因型差异，培育耐低氮的棉花品种，是降低棉花氮肥用量、减少环境污染、提高植棉效益的重要途径之一。耐低氮品种应该能够以较低的氮含量水平维持其正常的生理功能，构建自身较大的生物量，筛选植物耐低氮基因型最直接和客观的方法就是在缺素土壤种植，用生物产量和经济产量进行综合评价[10]。但田间全生育期试验耗时、耗工，筛选效率低；本文利用苗期沙培，对某些指标进行快速的筛选，在不漏掉有用种质资源的前提下，适当缩小供试群体。

表7 第三批各品种综合得分D值Table 7 The third batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

目前耐低氮（氮高效）品种的筛选还缺乏统一的指标，不同的研究者采用不同的评价指标。韩璐[10]以相对干物质质量为主要筛选指标，结合相对氮利用效率和相对氮积累量进行棉花氮高效基因型的筛选。柴煜[21]定义相对耐低氮指数为有效穗数、每穗实粒数、单株产量和地上部生物量的相对耐性指数之和，对供试群体进行耐低氮评价。文春阳[22]以相对株高、相对有效穗数、相对生物产量、相对单株产量、相对结实率五者之和作为耐低氮指数，对水稻株系进行了耐低氮评价。黄亿[23]以籽粒产量为评价指标，将22份大麦材料划分为氮髙效利用基因型和低效利用基因型。严明建等[24]以水稻株高、千粒重、有效穗数、单穗粒数、始穗期、穗长进行关联分析筛选氮高效品种。氮高效吸收利用是多种因素综合影响的复杂性状，不同棉花材料对某一个具体氮高效特性指标的反应不尽相同，因此单一指标难以准确反映氮高效的强弱。文琴[15]在棉花钾高效筛选的研究中利用主成分分析求出各品种的每一个综合指标值 CI（1）、CI（2）及相应的隶属函数值U（1）、U（2）后，依据2个综合指标的相对重要性（权重）进行加权，得到各品种耐低钾性的综合评价值（D值），筛选出耐低钾品种，并且进一步开展全生育期试验验证了该方法可行。该方法将原来的多个指标转换成为新的个数较少且彼此独立的综合指标，按其贡献率大小赋予权重，既克服了单项指标的片面性，又克服了综合过程的主观性，使各品种的性状得以量化[15]。翟荣荣等[16]也利用主成分分析、隶属函数和聚类分析筛选出耐低氮晚粳稻品种。本研究采用这种评价方法，初步筛选出耐低氮品种中棉所45、中棉所49、中棉所14、中棉所69、中棉所35、新陆早45、新陆早23号、惠远717、新陆早 12号、豫棉 12、辽棉 28号、泛棉3号、岱红岱、邯7860、光叶岱字棉、沧198、科林 098、银山 4号、新陆早 20号、邯 667、邯 686、石早1号、新陆早 42、石早3号、邯656、新陆早25号、新陆早39号、鲁棉2153、邯2490、新陆早17号、川338、辽棉10号。鉴定和筛选耐低氮棉花资源的目的是选育耐低氮性较强的高产棉花品种。然而，棉花基因型的耐低氮性和高产性并不存在确定的对应关系。因此下一步应在本研究的基础上，进行全生育期的土培试验筛选耐低氮的高产品种。

表8 第四批各品种综合得分D值Table 8 The fourth batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

4 结论

通过分析供试270个棉花品种适氮和低氮两个氮水平下SPAD值、总干物质质量、氮积累量等指标，利用主成分分析法和隶属函数法初步筛选出中棉所35、中棉所69、中棉所14、中棉所49、中棉所 45、豫棉 12、新陆早 12号、惠远 717、新陆早23号、新陆早45号、银山4号、科林098、沧198、光叶岱字棉、邯7860、岱红岱、泛棉3号、辽棉 28号、新陆早 20号、邯 667、邯 686、石早1号、新陆早42、石早3号、邯 656、新陆早25号、新陆早39号、鲁棉2153、邯2490、新陆早17号、川338、辽棉10号32个耐低氮品种；中棉所64、中662、中棉所27、中棉所17、中棉所 19、新陆中15号、新陆早53号、新陆中22号、新陆中17号、豫棉21、鸭鹏棉、国欣棉9号、赣棉12号、宁棉1号、珂字201、赣棉47、鄂岱棉、新植棉5号、苏棉22、运早 N95、奥试棉 4406、关农早 C-50、TM-1、鲁05R59、国欣棉11号、新棉 33B、运早N177、岱字棉14号、春南保、新陆早9号、甘棉4号、军棉1号32个氮胁迫敏感型品种。