基于SSR标记新疆陆地棉的DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析

王欣怡 ，李雪源 ，龚照龙 ，王俊铎 ，范李萍 ，郑巨云 ，梁亚军 ，郭江平 ，买买提·莫明 ，艾先涛 *

（1.新疆农业大学农学院/农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐830052；2.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐830091）

新疆是我国棉花的主产区，以超过50%的面积贡献了近3/4的产量，为保障我国棉花生产安全发挥了重要作用。近年来，随着种业发展速度的加快，市场化程度的提高，棉花品种同质化、种子质量下降、品种套牌等问题突出，严重影响棉花产业的健康发展。此外，骨干亲本的反复利用及转基因技术在棉花育种中的应用导致品种间遗传差异越来越小，仅依据传统形态学手段难以满足品种鉴定需求[1]。因此，加强检测技术创新，为种子质量鉴定提供高效技术手段极为必要。

分子标记绘制的品种指纹图谱像人的指纹一样具有特异性，能够快速准确鉴定品种或品系，为作物育种和种子管理提供了极大的便利[2]。相较于其他分子标记，以微卫星序列（Simple sequence repeats,SSR）为基础的标记具有扩增稳定、多态性高等诸多优点，因此被广泛应用于作物指纹图谱构建中[3-4]。1996年郭旺珍等[5]利用随机扩增多态性DNA （Random amplified polymorphic DNA,RAPD）标记对我国9个棉花主栽品种构建了指纹图谱。李育强等[6]利用SSR分子标记方法构建了长江流域湘杂棉系列品种的指纹图谱。匡猛等[7]以32个棉花品种为材料，利用SSR标记为其构建了DNA指纹图谱，并指出核心引物组合法更适合棉花指纹图谱构建的工作。聂新辉等[8]利用40对SSR引物构建了51份新陆早系列品种的指纹图谱。张玉翠等[9]利用40对SSR引物为32份棉花主栽品种构建了DNA指纹图谱。符家平等[10]选用8对SSR核心标记为棉花杂交种C111建立了DNA指纹，给杂交棉的纯度检测提供了分子水平上的参考。付小琼等[11]以中棉所63为研究对象，选用SSR引物建立了该品种的DNA指纹，旨在保护中棉所63的品种权。

已有的关于新疆陆地棉品种指纹图谱的研究大多针对早熟棉品种，研究结果缺少代表性。本研究收集了从1979年至2013年近40年间新疆审定的120个陆地棉品种，利用SSR标记构建其指纹图谱，为今后棉花品种DNA指纹鉴定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从1979年至2013年近40年间新疆审定的120个陆地棉品种（品种名称、系谱来源及选育单位见本文在《棉花学报》网站的电子资源附表1）包括军棉1号、新陆早系列品种62份和新陆中系列品种57份，来源于新疆巴州农业科学研究所种质资源库及各育种单位。

1.2 棉花基因组DNA的提取

待植株苗期摘取幼嫩叶片，利用改良CTAB法[12]结合自动磨样机快速提取棉花基因组DNA。利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度与浓度。

1.3 SSR引物来源

引物信息来源于CMD数据库、CottonDB数据库以及文献资料[8,13-14]公布的引物，选择有染色体定位信息的SSR标记共计586对，引物包括DPL、CGR、NAU、BNL 和 JESPR 等类型，由华大科技（广东深圳）有限公司合成。

1.4 PCR扩增及电泳分析

PCR（Polymerase chain reaction）反应体系包括 DNA 模板（60 ng·μL–1）1 μL，正、反向引物（4 pmol·μL–1） 各 0.5 μL，10×缓冲液 1 μL，dNTPs（各 2.5 mmol·L–1）0.2 μL，Taq 酶 （5 U·μL–1）0.1 μL 和 ddH2O 6.7 μL。

PCR反应程序为，94℃预变性3 min；然后94℃变性 45 s，55℃退火 35 s，72℃延伸 45 s进行30个循环；72℃延伸12 min；4℃保存。PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，电泳结束后用快速银染法[15]染色观察结果。

1.5 数据分析

根据PCR产物在凝胶上的相对位置，每对引物生成的不同基因型直接编号，构建120个陆地棉品种的DNA分子指纹图谱。其中电泳结果采用二进制0，1系统记录谱带位置，某一扩增条带有带记为1，无带记为0。将每对引物在品种间扩增得到二进制数据转化成十进制数据，由引物组合的十进制数字串作为每个品种的数字指纹。在进行数据转化时，以位数最多的十进制数为标准，位数不足的加 “0”补足位数。利用NTSYS-pc 2.10进行遗传多样性分析。根据SimQual程序求Jaccard相似系数；采用类平均法（Unweighted pair group method arithmetic averages,UPGMA），对遗传相似系数矩阵进行聚类，并绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

查阅系谱资料，选择8份亲缘关系较远的材料对586对候选引物进行初步筛选，得到190对初筛引物，占引物总数目32.4%。随后对120个材料复筛，最终确定78对多态性高、带型清晰的SSR引物定为本次试验的核心引物（引物具体信息见本文在《棉花学报》网站的电子资源附表2）。引物选择按照染色体分布原则，综合考虑多态性、稳定性和重复性，每条染色体选择3对引物。不同染色体上的标记检测到的等位位点个数、多态性位点个数都有很多差异。78对核心引物在120个材料中共检测392个等位变异，平均等位变异数5.03，变幅为2～10；其中多态性位点324个，多态性比例达82.7%。

2.2 SSR指纹图谱构建

利用上述78对核心引物对120个新疆陆地棉品种进行SSR指纹分析。结果显示，具有特征谱带的品种共计17个（表1），仅用1对特征引物即可与其它品种区分开。其中，新陆中43号有4对特征引物；新陆早41号与新陆中31号有2对特征引物；另外14个品种各有1对特征引物。引物NAU5128在新陆早4号、新陆早24号、新陆中15号、新陆中31号中均表现出特征谱带；引物NAU2083在新陆中6号、新陆中31号、新陆中43号、新陆中59号中表现出特征谱带，且将其余116个品种区分为12个类型，表明引物NAU2083多态性较丰富，在进行品种鉴定时可优先采用。就本研究而言，仅仅依靠特征引物难以完成120个品种的鉴别，因此还需要采用引物组合法进一步提高引物的鉴别能力。

表1 具有特征引物的17个棉花品种Table 1 Primers with specific amplifications for cotton cultivars

构建指纹图谱的原则是选用最少的引物数目以区分尽可能多的品种。本研究从78对核心引物中优先选择多态性丰富的引物，对120个棉花品种进行指纹分析。结果显示，当选择NAU2083、CGR5651、BNL1694、CGR5707 以 及CGR5576这5对引物进行组合时，可以鉴别76个品种。增加MUSS95和HAU1413这2对多态性相对丰富的引物，可鉴别105个品种。剩余的15 个 品 种 可 以 利 用 TMB2295、BNL3937、NAU1102、GH277以及 NAU3732这5对引物将其区分开。这12对引物（表2）按照以上顺序组合鉴定，可将120个品种完全区分开。图1为引物NAU2083对部分棉花品种的扩增结果。

本研究中，完成指纹图谱构建所需引物数目共计12对。经统计，这些引物扩增得到3～9种等位变异，共74个等位位点。采用“0、1”法记录谱带，将二进制01数据转化为十进制数据，用转化后的十进制数据构建了120个陆地棉品种的指纹图谱。以新陆早1号为例，引物NAU2083的扩增结果为100110111，将该二进制数据转化为十进制数据为311，由9位数变为了3位数；CGR5707的扩增结果为11111111，转化为十进制数据为255，由8位数变为了3位数。12对引物组合得到的十进制数字串即代表每个品种的数字指纹（120个品种的SSR指纹图谱见本文在《棉花学报》网站的电子资源附表3）。

表2 12对SSR引物信息Table 2 List of 12 primer

图1 引物NAU2083对部分棉花品种的扩增结果Fig.1 DNA fragments amplified by SSR primer NAU2083 in partial cotton cultivar

2.3 遗传多样性分析

利用NTSYS-pc 2.10软件依据SSR标记所统计的基因型数据，采用Jaccard系数计算出120个供试品种的成对遗传相似系数。结果表明，120个供试品种之间的遗传相似系数变化0.50～0.96，平均为0.73；遗传相似系数偏高，表明新疆陆地棉品种之间的遗传水平较狭窄。其中，相似性系数最高的2个品种是新陆早27号和新陆早28号，这2个品种均有贝尔斯诺的遗传基础；相似系数最低的2个品种是新陆早22号和新陆中60号，说明它们之间的遗传差异较大。

参照遗传相似系数矩阵，采用类平均法（UPGMA）进行聚类，结果见图2，在相似系数0.68处可将120个品种分为三大类群。第一大类群包含92份品种，其中48份新陆早系列，44份新陆中系列。从聚类结果可以看出，具有相似遗传背景的品种被聚在一起。新疆农垦科学院选育出的新陆早42号和新陆早51号均含有新陆早10号的遗传背景被聚成一类；新陆早10号和新陆早15号均有中棉所12号的遗传背景，也很好地聚为一类；被聚在这一大类群中的品种还有新陆早6号、新陆早16号、新陆早28号、新陆早25号、新陆早39号、新陆早9号、新陆早71号、新陆早27号以及新陆早79号，它们均含有贝尔斯诺的遗传背景；新陆中40号和新陆中42号的遗传背景相似被聚在一起。此外，选育单位相同的品种也被聚为一类，由新疆康地种业选育的新陆中31号、新陆中39号，新疆巴州农业科学研究所选育的新陆中41号、新陆中47号，新疆农垦科学院选育的新陆早40号、新陆早60号均被聚在一起，说明各育种单位在品种选育时所采用的亲本材料遗传基础较狭窄，在环境压力和人为选择作用下使得相同单位选育的品种具有较高的相似度。第二大类群仅包含12个品种，其中10份为新陆早系列，2份为新陆中系列。由新疆农垦科学院选育的新陆早32号、新陆早44号及新陆早45号被聚在第二类群；其中新陆早45号是利用新陆早13号做母本，以9941做父本杂交选育而来，因此也被聚在了这一类群中。第三大类群包含16份品种，其中4份为新陆早系列，12份为新陆中系列。从聚类图中看出，相同选育单位的品种被聚在了一起，由新疆康地种业选育的新陆中25号、新陆中38号，新疆巴州农业科学研究所选育的新陆中63、新陆中64，农一师农业科学研究所和塔河种业选育的新陆中48、新陆中60及新陆中62均被聚在第三类群。

图2 120份棉花品种的UPGMA聚类分析图Fig.2 UPGMA clustering analysis figure of 120 cotton cultivars

3 讨论

分子标记技术的发展促进了品种鉴定方法的不断进步，通过构建DNA指纹图谱快速鉴别品种真实性和纯度，已成为当今品种鉴定技术的发展趋势，其中SSR标记被认为是品种鉴定较为理想的标记之一[16]。品种DNA指纹图谱鉴定主要有3种方法，具体包括特征谱带法、引物组合法和核心引物组合法。120个供试材料中17个品种在24个标记位点上具有特征谱带，在构建品种DNA指纹图谱时，使用起来简单快速。但就本研究而言，只有少部分品种具有特征引物，若要获得更多品种的特征引物还需进行大量的引物筛选工作，且随着品种数量的增加，原来在某品种上表现为特征谱带的引物，有可能在其它品种上出现相同的带型，即特征谱带是相对的，只有在固定的材料范围内有效，鉴别能力相对有限。

在进行品种鉴别时，通常会利用尽可能少的标记以鉴别最多的品种。其中，核心引物组合法在构建作物DNA指纹图谱时十分有效。在棉花DNA指纹图谱构建中，韩宗福等[17]、张玉翠等[9]、聂新辉等[8]进一步验证了核心SSR引物组合的适用性。通过不同引物的组合，可以大大提高引物的鉴别能力，本研究采用12对引物可将120个棉花品种完全区分开。但今后随着棉花种质资源的不断丰富，这12对引物的鉴别能力可能会有所下降，因此可根据实际情况适当更换引物或增加引物数目，这与李成奇等[18]研究一致。

目前，SSR指纹图谱有各式各样的表达方式[19-22]。最常见的是电泳图谱，即直接用扩增得到的电泳胶片代表品种的指纹信息。张玉翠等[9-10]利用这种方法，对32个棉花主栽品种进行了指纹图谱的构建。其次，还可以根据分子量片段的大小，估算目的条带的大小以建立品种指纹数据。叶春秀等[23]采用该方法对41个早熟陆地棉品种进行了指纹图谱研究。除此之外，另1种常见的方法是以01数字串记录品种指纹信息，即用扩增得到的01数据组合直接表示品种指纹。其中，薛艳等[24]利用该方法构建了42份新疆早熟棉的SSR指纹图谱。本研究所选用的材料数量较为全面，共计120个品种，要区分这些材料所需引物数目为12对。如果直接用01数据表示品种的指纹图谱，数据较为庞大，记录观察不方便，因此我们对扩增得到的01数据转化为十进制，构建了以上试验材料的数字指纹。

应用NTSYS-pc v2.1对其遗传多样性水平作出评价，聚类结果与系谱来源具有较高的相关性，在相似系数0.68处，所有的品种被分为三大类群。120个新疆陆地棉品种遗传相似系数矩阵和聚类结果表明，新疆陆地棉品种之间遗传多样性水平较低，说明品种之间遗传背景差异不大，遗传基础相对较窄，总体上遗传多样性不够丰富，这与聂新辉等的研究结果相似[8]。

4 结论

以近40年间新疆审定的120个陆地棉品种为材料，从586对SSR候选引物中筛选出多态性高、稳定性好、均匀分布于棉花26条染色体的78对核心引物。这些SSR核心引物对新疆陆地棉品种具有良好的区分能力，通过12对多态性引物组合构建了120个新疆陆地棉品种指纹图谱，将120个陆地棉品种聚为3大类型，遗传多样性较狭窄。构建的指纹图谱可为今后新疆陆地棉种质资源保护和品种鉴定奠定了基础。