高效液相色谱法在测评乳制品安赛蜜中的应用

◎ 阮金如

（红河州食品药品检验所，云南 红河 661100）

发酵乳是以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH降低的产品。乳酸是以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、接种嗜热链球菌和保加利亚杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种）发酵制成的产品，按GB 19302-2010《发酵乳》执行[2]。在日常生活中，最常见的发酵乳是酸奶，其感官要求包括色泽等。为增加发酵乳的甜度，大部分乳制品企业会在生产过程中添加过量的安赛蜜，并不按照相关标准添加。

安赛蜜又叫乙酰磺胺酸钾，是一种食品添加剂，类似于糖精，易溶于水，可增加食品甜味，其没有营养，口感好[3]，无热量，具有在人体内不代谢、不吸收（是中老年人、肥胖病人、糖尿病患者理想的甜味剂），对热和酸稳定性好等特点，是当前世界上第四代合成甜味剂。安赛蜜为人工合成甜味剂，经常食用合成甜味剂超标的食品会对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对老人、孕妇、儿童的危害更为严重。如果短时间内大量食用，会引起血小板减少导致急性大出血。通过测评乳制品中安赛蜜的含量，能帮助人们在选购酸奶时，知道安赛蜜的含量，减少因食用安赛蜜后带来的危害。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪 Agilent 1200 HPLC 系统（美国），配置G1322A型四元梯度泵、G1311型二极管阵列检测器、G1329A型柱温度箱、G1316A型自动进样器、Agilent Chemstation色谱工作站（version B.04.02），超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司KQ-300DE型)，离心机（湘仪H1580型)，电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司，AR224CN型），隔膜真空泵（津腾GM-0.33型），滤膜（津腾微孔滤膜（有机系）直径50 mm，孔径0.45 μm）。

1.1.2 试剂

甲醇：色谱纯，购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，纯度大于99.9%，批号20160606；乙腈：色谱纯，购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，纯度大于99.9%，批号20160605；硫酸铵：分析纯，购于天津市风船化学试机科技有限公司，纯度大于99.0%，批号20160109；10%硫酸溶液：优级纯，购于广州汕头市酉陇化工有限公司，含量95%～98%，批号20161016；乙酸铵：购于天津市科密欧化学试机有限公司，纯度大于98.0%，批号20160110；无水乙醇：购于天津市风船化学试机有限公司，纯度大于99.7%，批号20161015。

1.2 高效液相色谱检测条件

高效液相色谱仪 Agilent 1200 HPLC 系统（美国安捷伦）；紫外检测器；自动进样器；液相色谱柱：Dimonsil C18（2）：cat#99603，5 μm，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇∶乙酸铵=10∶90；流速：1.000 mL/min；波长：214 nm；进样量：20.00 μL；分析时间：10 min；柱温：30 ℃。

1.3 实验步骤

（1）流动相的配制。称取1.54 g乙酸铵于100 mL的烧杯中搅拌溶解，转移至2000 mL烧杯中，采用蒸馏水少量多次洗涤，洗涤溶液合并转移至2000 mL烧杯中，并加入蒸馏水至1000 mL刻度线，使用玻棒搅拌混和均匀，并超声5 min，排除CO2，此溶液需现配现用。

雨过天晴，刚出世的婴孩静静地睡去了。风吹拂着林梢，树枝上那根湿漉漉的红腰带，在凄惶的寒风中飘动着。阳光透过云层，照耀着潮湿的林间，湿气氤氲中，倒也添了此许温暖。红琴问风影什么时候回寺院，他一声不吭。许久，他才说，红琴，我们一起回家吧。她茫然地望着他，一头雾水。他再次说，回家吧。随即，他上前扶起她，抱起熟睡的婴儿，他们相扶着，一步一步地朝林子外边移去。

（2）样品前处理。称取2.00 g酸奶样品于10 mL具塞比色管中，加无水乙醇5.0 mL并加蒸馏水稀释至10.0 mL，摇晃混匀并超声10 min。超声完毕，将溶液转移至离心管中，并于离心机上6000 r/min离心5 min。将离心后的溶液用定量滤纸过滤，得到的滤液并采用接0.45 μm过滤头的注射器过滤至2 mL进样瓶中，待测。

（3）仪器检测。将待测样品于高效液相色谱检测条件下排序检测。

（4）数据处理。采用Origin70绘制相关图谱及标准曲线，采用外标法进行定量。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

国家标准GBT 5009.140-2003中的流动相组成和比例较为复杂。流动相分别用到硫酸铵、甲醇、乙腈和稀释为10%的硫酸。其中，硫酸铵800 mL、甲醇150 mL、乙腈50 mL、10%硫酸1 mL，且要求放入同一个瓶子中，超声混匀。由图1可以看出，国家标准方法检测乳制品中安赛蜜的色谱图分离度不好且出现干扰峰。因此，本文在此基础上改进流动的种类，寻求低成本、操作简单的流动相。以云南乍甸乳业有限责任公司生产的牛乳之房（样品1）、乳酸菌饮品（样品2）和云南多喝乳业有限责任公司生产的原风味酸奶（样品3）、草莓调制乳（样品4）为研究对象，考察流动相改进前后的高效液相色谱图，其对照图如图2所示。实验结果表明，采用含乙酸铵的甲醇作为流动相色谱图分离度较好，没有干扰峰的出现。所以，此方法适用于测定乳制品中安赛蜜的含量，同时也适用于测定食品中安赛蜜含量。

图1 国家标准法检测乳制品中安赛蜜色谱图

图2 新方法检测乳制品中安赛蜜色谱图

2.2 流动相比例的选择

流动相比例是高效液相色谱法进行定性定量分析的关键参数，因此，实验对流动相的比例进行考察。以样品1为研究对象，考察流动相比例对样品分离的影响。将所得待测液按1.2色谱条件进样，考察的流动相（甲醇∶乙酸铵）比例分别为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75和30∶70。将色谱图原始数据用相似度软件进行分析，分析后可知在流动相（甲醇∶乙酸铵）比例为10∶90的条件下，色谱图分离得最好，故选流动相（甲醇∶乙酸铵）比例为10∶90。

2.3 流动相流速的选择

流动相的流速也是高效液相色谱法进行定性定量分析的关键参数，因此，实验对流动相的流速进行考察。以样品1为研究对象，根据1.3中的（2）（3）处理样品，考察了流动相比例对样品分离的影响。将所得待测液按1.2色谱条件进样，其中检测条件流动相、波长、梯度洗脱、柱温、进样量不变，改变流速为0.800、1.000、1.200 mL/min。将色谱图原始数据用相似度软件进行分析，后可知流速0.800、1.000、1.200 mL/min图谱差异不大，出峰都可以。但由于在0.800、1.200 mL/min条件下的保留时间发生位移，相似度较差。故选泽流动相流速1.000 mL/min。

2.4 线性回归方程、线性范围

对配制的标准工作溶液分别于高效液相色谱仪上检测分析，结果见表1，其中浓度为0.01 mg/mL的色谱图见图3。同时比较了标准品与样品的色谱图，如图4所示。

表1 工作标准溶液检测结果表

图3 标准品中安赛蜜含量的检测色谱图

图4 样品和标准品中安赛蜜含量检测对比色谱图

2.5 分析方法的考察

2.5.1 重复性实验

取同一供试样品平行制备3份供试溶液，考察样品中各成分含量的RSD，以此结果验证是否满足色谱图的测定要求。安赛蜜的含量（n=3）分别为0.025、0.024、0.027 g/kg，RSD分别为4.3%、3.8%、5.5%。表明重复性好。

2.5.2 稳定性试验

取供试样品溶液，分别在0 h、5 h、15 h进行样品稳定性情况考察。查看各组分的峰面积以及相对保留时间的RSD，以此证明样品溶液时间的稳定性。各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.5%，相对峰面积的RSD小于10%，建立的色谱图谱精密性比较好。说明样品在15 h内稳定。

2.5.3 加样回收率实验

制备3份供试品溶液，另制备一个不加对照品溶液的空白对照溶液，以确定回收率，结果见表2。

表2 乳制品中安赛蜜成分加标的回收率

结果表明，方法的精密度、重复性、稳定性和回收率均良好，满足定量要求。

3 结论

通过改变国家标准方法中的流动相，建立安赛蜜的色图谱，采用Origin70软件对色图谱进行分析对比。结果如下：①国家标准方法的流动相分别用到硫酸铵、甲醇、乙腈和稀释为10%的硫酸4种不同的化学试剂且配制复杂，特别是硫酸的稀释，容易烧伤皮肤，稀释过程中释放的烟雾刺激人体呼吸系统，而自创方法中的流动相配制简单且安全。②国家标准方法得到的色谱图分离程度不够明显，出现干扰峰，影响对安赛蜜出峰的判断，自创方法得到的色谱图分离度较好，没有干扰峰的出现，能对安赛蜜的出峰情况和时间有一个很好的把控。同时，视觉效果比国家标准法好。③自创法得到的标准回归曲线良好，R2=0.99988。④自创法中方法的精密度，重复性，稳定性均良好，RSD值小于10%，加样回收率分别为103%、107%、110%，RSD值也小于10%。⑤通过自创法，测得的安赛蜜含量与供试品标签上标的基本一致。

综上所述，该实验所建立的高效液相色谱法测评乳制品中安赛蜜的分析方法快速、简单，方法可靠，可运用其他乳制品中安赛蜜含量的测定。