菟丝子黄酮对大鼠激素型骨质疏松症防护作用及机制研究

郭晓东

(辽宁省沈阳市第九人民医院，辽宁 沈阳 110024)

骨质疏松症是骨组织显微结构改变的一种全身性骨骼疾病，由于骨量减少，骨脆性增加，患者常伴有腰背疼痛、身长缩短，易发骨折，甚则引发呼吸功能下降，严重影响人们的生活质量[1-2]。由于女性绝经后卵巢功能减退，体内雌激素水平下降，从而打破骨生成和骨吸收之间的平衡，所以该病尤易发生于绝经后妇女[3]。所以，对激素型骨质疏松症的防治研究已经引起学者们的广泛关注。中医认为肾主骨生髓，肾虚是骨质疏松症的根本病因[4]。菟丝子是一年生的双子叶草本植物，具有补肾益精作用，菟丝子黄酮是其主要活性成分，具有雌激素样活性[5]。本实验采用经典双侧切除大鼠卵巢法[6]制备骨质疏松模型，通过观察菟丝子黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松症骨物理生长、骨密度、血清生化及骨保护蛋白等相关指标的影响，探讨其骨保护作用及机制，为其临床用于骨质疏松症的防治提供理论依据。

1 实验资料

1.1 动物及药物 SPF级SD雌性大鼠40只，体质量(230±10)g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001；菟丝子黄酮粉购自上海源叶生物科技有限公司；己烯雌酚购自广东彼迪药业有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 血清钙(Ca)、磷(P)及碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。骨保护蛋白(OPG)及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax多克隆抗体购于美国Santa公司。TriStar2 LB 942型多功能酶标仪(伯托公司，德国)，电子天平(赛多利斯，德国)，双 能 X 射线 骨 密度仪( HOLOGIC 公司，美国)，SHZ-88型水浴恒温振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，BX51-WIF型Stratos型台式多功能冷冻高速离心机(赛默飞世尔有限公司，德国)，Trans-Blot SD型半干转转膜仪(Bio-Rad，美国)，F3型全自动荧光与可见光凝胶成像分析系统(Syngene，英国)。

1.3 分组、造模及干预 将40只SD雌性大鼠随机分成假手术组、模型组、中药组和西药组，每组10只。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，除假手术组外，其余组大鼠均行腹侧入路双侧卵巢摘除手术建立骨质疏松模型，假手术组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织。缝合切口，外敷消炎粉。术后分笼饲养，每日消毒，4周后，中药组大鼠每天给予菟丝子黄酮0.1 g/kg灌胃，西药组大鼠每天给予己烯雌酚30 μg/kg灌胃，假手术组及模型组大鼠每天给予等体积生理盐水灌胃，灌胃时间均为12周。

1.4 相关指标检测

1.4.1 腰椎骨密度 于手术前和灌胃12周后，采用双能X射线骨密度仪对大鼠进行腰椎骨质平扫，采集4个部位，并取平均值。

1.4.2 血清Ca、P及ALP水平 各组大鼠麻醉后腹主动脉取血，分离血清，-20 ℃保存，严格按照试剂盒说明书测定血清Ca、P及ALP水平。

1.4.3 骨物理生长指标 完整取出大鼠左右两侧股骨，剔净附着的软组织和软骨。左侧股骨60 ℃恒温烘烤至恒重后用电子天平称质量并测量骨物理生长指标。

1.4.4 股骨OPG、Bcl-2、Bax蛋白表达水平 取右侧股骨，骨组织以液氮冷冻后钢锤砸碎加入超声裂解细胞，超声裂解后12 000 r/min离心40 min，取上清蛋白溶液，蛋白定量后，以50 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，半干转至PVDF膜，加入1∶500兔抗人OPG、Bcl-2、Bax一抗，4 ℃封闭过夜，TBST洗涤3次，每次10 min。加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤4次，每次10 min。按试剂盒说明书混合适量发光液A和B避光保存，将膜放在曝光板上，膜上滴适量的发光液，应用全自动荧光与可见光凝胶成像分析系统曝光分析图片。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清Ca、P及ALP水平比较 模型组大鼠血清Ca水平明显高于假手术组(P<0.05)；西药组血清Ca水平明显低于模型组(P<0.05) ，中药组血清Ca、ALP水平均明显高于模型组及西药组(P均<0.05) 。见表1。

表1 各组大鼠血清Ca、P及ALP水平比较±s)

注：①与假手术组比较,P<0.05；②与模型组比较,P<0.05；③与中药组比较,P<0.05。

2.2 各组大鼠骨物理生长指标比较 模型组大鼠骨质量指数明显低于假手术组(P<0.05)；中药组与西药组大鼠骨质量指数均明显高于模型组(P均<0.05)，已接近正常水平；各组大鼠股骨的长度和宽度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠骨物理生长指标±s)

注：①与假手术组比较,P<0.05；②与模型组比较,P<0.05。

2.3 各组大鼠腰椎骨密度比较 术前，4组大鼠腰椎骨密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；灌胃12周后，模型组、中药组和西药组大鼠腰椎骨密度均明显低于术前(P均<0.05)，且模型组大鼠腰椎骨密度明显低于假手术组、中药组与西药组(P均<0.05)，中药组与西药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠腰椎骨密度比较±s，g/cm2)

注：①与术前比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.4 各组大鼠股骨OPG、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较 模型组大鼠股骨中Bax蛋白表达水平明显高于假手术组(P<0.05)，而Bcl-2、OPG蛋白表达水平明显低于假手术组(P均<0.05)；中药组与西药组大鼠股骨中Bax蛋白表达水平明显低于模型组(P均<0.05)，而Bcl-2、OPG蛋白表达水平明显高于模型组(P均<0.05)；中药组与西药组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 各组大鼠股骨OPG、Bcl-2、Bax蛋白表达水平

3 讨 论

有调查研究表明，骨质疏松症的发病率随着年龄的增长而升高，绝经后的女性机体内雌激素分泌水平急速下降，尤易诱发骨代谢紊乱而发为此病，我国目前已有2.1亿人骨量低于正常标准[7-8]。临床上常采用雌激素疗法防治骨质疏松症的发生发展，但长期单纯补充雌激素会增加子宫内膜癌、乳腺癌等其他疾病发生的风险，如何防治骨质疏松症的发生发展已成为广大医学工作者研究的热点。

中医认为，肾虚是导致骨质疏松症发生的根本病机，肾虚不能生精化髓，骨骼失于濡养，脆弱无力而发为本病[9]，故治宜补肾生精。菟丝子为补肾方中常用的君药，其有效成分菟丝子黄酮可以显著升高大鼠血清中雌激素水平，同时还具有抗凋亡、抗氧化、调节内分泌等作用[5，10]。我国菟丝子资源丰富,所以开发利用菟丝子黄酮来防治骨质疏松症具有很好的发展前景。

骨物理生长指标、骨密度及血清Ca、P、ALP水平是评价药物治疗激素型骨质疏松症效果的重要指标[11-12]。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠血清Ca水平明显升高，P、ALP水平无明显变化，骨质量指数和腰椎骨密度显著降低,说明骨质疏松症模型复制成功；与模型组比较，中药组大鼠骨质量指数、腰椎骨密度及血清ALP水平均明显升高，但 Ca、P水平变化不明显，说明菟丝子黄铜对大鼠激素型骨质疏松症具有明显骨保护作用，但其对抑制骨吸收效果不显著，可能主要是通过促进成骨细胞功能活动从而增加骨的形成发挥作用。

细胞凋亡是由基因控制的细胞有序的自主死亡，但并不是在病理条件下的自体损伤，而是为了更好地适应生存环境去主动死亡的过程，涉及一系列基因激活、表达以及调控等的作用。有研究表明，成骨细胞凋亡在骨质疏松症的发生和发展过程中发挥着非常重要的作用[13-14]。为了进一步探讨菟丝子黄酮治疗骨质疏松症的机制，本实验选取与成骨细胞凋亡密切相关的Bcl-2、Bax[15]和具有判断“绝经后骨质疏松症理想指标”之称的OPG蛋白[16]作为研究靶点。Bcl-2属于抗凋亡成员，Bax则属于促凋亡成员，两者是一对负反馈调节因子[17]。OPG是一种分泌型蛋白，属于破骨细胞的负性调节因子，可以有效诱导破骨细胞凋亡，增加骨密度[18]。本实验结果显示，模型组大鼠股骨中Bax蛋白表达水平明显高于假手术组，Bcl-2及OPG蛋白表达水平明显低于假手术组；中药组与西药组大鼠股骨中Bax蛋白表达水平明显低于模型组，Bcl-2及OPG蛋白表达水平明显高于模型组。提示菟丝子黄酮可通过抑制成骨细胞凋亡发挥对骨组织的保护作用。

综上所述，菟丝子黄酮对大鼠激素型骨质疏松症具有很好的骨保护作用，并在分子水平上为菟丝子黄酮用于骨质疏松症尤其是激素型骨质疏松症的防治提供了有力的理论依据,也为后续深入探讨其作用机制提供了基础研究数据。