caspase-3在不同临床特征老年结直肠癌中的表达

结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是一种常见的、严重威胁人类生命健康的消化系统恶性肿瘤。在我国,其发病率与死亡率呈逐年上升的趋势[1]。临床经验告诉我们,早发现、早治疗可让CRC病人的手术后5年生存率从50%上升到90%以上[2-3]。因此,如何早发现CRC成为临床研究的重点。

以往的研究表明,CRC的发生、发展、转归与细胞凋亡调控有着密切的关系,细胞凋亡是细胞主动死亡的形式,caspase-3在促进细胞的凋亡中有着重要的作用。许多触发细胞凋亡的因素均是通过激活caspase-3来降解其酶底物,如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、DNA裂解因子(DFF)和Lamin B等。研究表明,caspase-3及其底物在CRC中表达降低,并与癌细胞的生长和转移密切相关[4]。老年人群是CRC的高发人群,因此本研究针对老年CRC病人进行caspase-3的表达检测,为进一步确定该指标作为老年CRC早期标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 病例选择 纳入2009年6月至2014年6月期间来我院就诊的老年CRC病人184例进行研究。所有病人年龄60～80岁,平均(76.42±10.73)岁,其中男102例,女82例。均为直肠腺癌,TNM分期Ⅰ期 19例,Ⅱa期21例,Ⅱb期32例,Ⅲa期54例,Ⅲb期42例,Ⅳ期16例。根据其分化程度,按broder法分为低分化(高度恶性)91例,中分化(高度恶性)54例,高分化(低度恶性)39例;肿瘤发生部位为上段34例,中段107例,下段43例;浸润深度T1 19例, T2 34例, T3 75例, T4 56例。本研究采用的血液样品为病人确诊后治疗前采集的血液,血液样品保存在-80 ℃超低温冰箱中留用。

1.2 入选及排除标准 入选标准:(1)病理学检查明确为直肠腺癌;(2)年龄60～80岁;(3)未并发其他严重疾病。排除并发其他严重疾病者。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 试剂:外周血RNA提取试剂盒(购自美国Invigrogen公司);反转录试剂盒(购自美国Promega公司);PCR预混料(购自大连TaKaRa生物公司);组织蛋白提取试剂盒(购自上海生工公司);鼠抗人caspase-3抗体、羊抗鼠HRP抗体(购自美国abcam公司);其他试剂均为分析纯试剂。

1.3.2 主要仪器:台式离心机、酶标仪(购自德国Thermo公司);Veriti FAST PCR仪(购自美国ABI公司);DYY-6C型高压电泳仪,凝胶成像仪(北京六一仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化检测caspase-3的表达水平:将病人直肠癌组织(手术及结肠镜下取得的标本)立即送检验科,即刻进行蜡块包埋,然后进行切片,封闭,加入含有终浓度为0.05% Triton X-100的PBS中进行通透,加入用PBS以1∶1000稀释鼠抗人caspase-3一抗,滴加在载玻片切片的位置上,37 ℃恒温培养箱中孵育3 h。用PBS溶液轻轻冲洗3次,每次5 min。用PBS以1∶3000的比例稀释生物素标记的羊抗鼠二抗,滴加在载玻片蜡块的位置上,室温或37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。用PBS溶液冲洗载玻片,轻轻冲洗5次,每次5 min。滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶),37 ℃孵育1 h。用PBS溶液冲洗载玻片,轻轻冲洗5次,每次5 min。使用DAB显色试剂盒进行显色,使用中性树胶封片。结果判定:以胎盘细胞胞浆或细胞周围棕黄色为阳性染色,每张切片选择5个高倍视野,计数不少于500个细胞,取均数并评分:不着色为0分,着色淡(浅黄色)为1分,着色深(黄褐色)为2分;着色细胞占计数细胞百分率: ≤5%为0分,6%～25%为 1分,26%～50%为2分,>51%为3分,染色程度与染色细胞百分率得分乘积为最后得分。0～1 分为阴性病例,2分以上为阳性病例。取材剩余组织低温保存在标准固定液中。

1.4.2 RT-PCR检测外周血caspase-3表达水平:使用外周血RNA试剂盒提取所有研究对象外周血总RNA,然后使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,然后吸取5μL 含cDNA的样品,加入10μL PCR预混料、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、4μL ddH2O,混匀后放入PCR扩增仪,以94 ℃ 5 min,然后94 ℃ 30 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,循环反应30个循环,72 ℃延伸10 min。将扩增产物取出后进行1%琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像仪下观察并拍照记录,有条带形成为阳性,无条带形成为阴性。Caspase-3上游引物序列:5′-AGAGCTGCACTGCGGTATTGAG-3′,下游引物序列:5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′;GAPDH内参上游引物序列:5′-ATCTTCCAGGAGCGAGAT-3′,下游引物序列:5′-TAAGCAGTTGGTGGTGCA-3′。DAB显色,采用图像分析测定仪量化caspase-3灰度积分比值,作为caspase-3蛋白相对表达量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件统计,计数资料以率表示,2组比较采用χ2检验,等级资料比较采用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测caspase-3的表达情况 免疫组化结果显示,TNM分期与caspase-3的表达呈反比,分期越高，caspase-3的阳性率越低,分化程度与caspase-3的表达呈正比,分化程度越高,caspase-3的阳性率越高。不同性别caspase-3的表达阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。60～70岁病人caspase-3的表达阳性率比71～80岁病人,但是2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同浸润深度与caspase-3的表达阳性率呈反比,随着浸润深度的增加，caspase-3的阳性率下降,不同肿瘤部位caspase-3的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 RT-PCR检测外周血caspase-3的表达情况 RT-PCR与免疫组化结果相似,TNM分期与caspase-3的表达呈反比,分期越高，caspase-3的阳性率越低,分化程度与caspase-3的表达呈正比,分化程度越高,caspase-3的阳性率越高。不同性别caspase-3的表达阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。60～70岁病人caspase-3的表达阳性率高于71～80岁组病人,但差异无统计学意义(P>0.05)。不同浸润深度与caspase-3的表达阳性率呈反比,随着浸润深度增加,caspase-3的表达阳性率下降,不同部位caspase-3的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 病人不同临床情况组织中caspase-3的表达比较

3 讨论

老年CRC是我国常见的恶性肿瘤,严重威胁着人类健康。近年来其准确的诊断和有效的治疗已成为医生以及科研工作者关注的热点问题之一[5]。基于相关位点的早期鉴别诊断方法的建立对于CRC的早期诊断、早期治疗以及提高病人的生存率就显得十分重要。

肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关,而且与细胞凋亡密切相关。Caspsae-3 是半胱氨酸蛋白酶家族中的一员,为执行细胞凋亡的关键酶之一,大多细胞凋亡途径都通过caspase-3 引发细胞凋亡[6-7]。有研究人员用S-P的方法检测了15例正常直肠黏膜、39例结直肠腺瘤和62例CRC标本的caspase-3的表达,结果显示,在正常结直肠黏膜、腺瘤和腺癌的caspase-3阳性表达率分别为80%(12/15),56.4%(22/39)、和45.16%(28/62),腺瘤和腺癌与正常结直肠黏膜比较,caspase-3的表达有明显差异[8]。

表2 RT-PCR检测病人外周血caspase-3的表达情况

郝建军等[9]对直肠癌组织中caspase-3的表达情况进行检测,结果显示caspase3在肿瘤组织中的阳性率为55.3%,与正常组织的表达率(78.6%)差异有统计学意义(P<0.05)。潘益峰等[10]对CRC和息肉中Caspase通路上基因表达水平进行检测,发现CASPASE基因在肿瘤的发生过程中相互作用,相互促进。王文娟等[11]对caspase-3在CRC中的表达进行检测,发现CRC组、腺瘤组caspase-3阳性表达率低于正常组,提示caspase-3表达与肿瘤分期呈反比。但关于老年这一特殊群体的caspase-3的表达情况尚未见报道。

本研究中,RT-PCR检测外周血caspase-3的表达情况与免疫组化结果基本一致,随着病人肿瘤分期的增加、分化程度的升高和浸润深度的增加,caspase-3的表达呈现下降趋势,表明caspase-3的表达受到抑制。老年人群是直肠癌的高发人群,本研究针对老年病人进行caspase-3的表达检测,了解其表达特点,为进一步确定caspase-3作为老年CRC早期标志物提供了依据。