重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗在肉鹅中的应用效果评价

谢向萌，韦显凯，梁 晟，覃小柳，梁仕增，闭璟珊，袁湖业，胡茂快

（1.横县动物疫病预防控制中心，广西横县 530300；2. 广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001；3. 横县陶圩镇农业站，广西横县 530314）

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）感染禽类及其它易感动物引起的一种烈性、高度接触性人兽共患传染病。根据表面血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因不同，AIV可分为16种H亚型和9种N亚型。其中，可感染人的亚型有H5N1、H5N6、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7、H10N8等[1-5]。AIV的传播扩散不仅对农业生产造成巨大危害，也对人类健康构成严重威胁。

2013 年2—3月间，我国上海､安徽等长三角区内省份发生了严重的人急性下呼吸道感染，经中国疾病预防控制中心鉴定，确定病原为H7N9流感病毒[6]。与其他亚型流感病毒一样，H7N9亚型病毒一直在不断进化，并获得了在哺乳动物体内大量繁殖和毒力增强的能力，导致人感染和死亡[7]。2017 年以前，在家禽中分离的 H7N9 病毒绝大多为弱毒株，对家禽没有致病力。2017 年后的监测结果显示，有些地区的H7N9 病毒已突变为高致病性毒株，对鸡有高致病力，而且流行范围有扩大趋势，对养禽业带来极大威胁[8-9]。

鉴于人间和禽间H7N9疫情防控形势的变化，2017年6月农业部要求广东、广西先行开展H7N9流感免疫试点工作，采用重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re1株）进行免疫注射。为评价该灭活疫苗在商品肉鹅中的安全性和有效性，进行了田间免疫试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re1株）：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号为2017002。

1.1.2 试验动物 来自同一种鹅场、同一批次临床健康商品代肉雏鹅（狮头鹅），未经H5禽流感病毒疫苗或“H5+H7”重组禽流感病毒疫苗免疫。1.1.3 主要试剂 禽流感病毒血凝抑制抗原H5N1 Re-8株和H7N9 Re-1株：哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.2 安全性及效力试验

1.2.1 安全性试验 取2周龄雏鹅400只，平均分为2组，分别进行单剂量和大剂量安全试验。每组分别采用肌肉和颈部皮下注射两种方式，数量各100只。单剂量安全试验注射剂量为0.5 mL/只，大剂量为1.0 mL/只。另取2周龄雏鹅20只为对照，以相同剂量和方式注射生理盐水。接种疫苗后，每日观察各组的采食、饮水及精神状况，判断是否有不良临床反应。14 d后，疫苗接种组每组剖杀5只，对照组剖杀2只，观察注射部位是否有炎症反应，以及疫苗吸收情况和脏器病理变化。免疫前及出栏前，每组随机取20只鹅称重，统计接种疫苗组和对照组的增重情况。

1.2.2 效力试验 取2周龄雏鹅500只，肌肉注射接种疫苗（0.5 mL/只），3周后以相同途径加强免疫1次（1.5 mL/只）。免疫前和免疫后每周采血分离血清，分别检测H7N9 Re-1和H5N1 Re-8株抗体，每次随机取30只，直至出栏。对每次随机选取的30只免疫鹅，全部采集喉/泄殖腔棉拭子，进行H7N9病毒分离；若病毒分离阳性，则进一步进行鉴定。

1.3 抗体检测

按《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T18936-2003）中的血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）试验要求，进行HI抗体效价测定。采用SPSS statistics 17.0，对检测数据进行统计分析。分析结果描述：P＜0.01表示差异极其显著，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示无显著差异。

2 结果

2.1 安全性试验

观察发现，单剂量和大剂量肌肉注射、颈部皮下注射，以及对照组的采食、饮水及精神状况均正常，未见不良临床反应。

接种后14 d，疫苗接种组每组剖杀5只鹅，对照组剖杀2只，进行病理检查。肌肉注射组：在注射部位均未观察到炎症、疫苗残留现象，疫苗吸收良好（图1-A、图1-E）；气囊清净透明；心、肝、脾、胃、肺、肠管正常；淋巴结、胰腺正常；喉头、咽喉、气管正常（图1-B、图1-F）。皮下注射组：注射部位无炎症，但发现大剂量接种组有2只出现少量疫苗残留，疫苗吸收不完全（图1-C、图1-G）；气囊清净透明；心、肝、脾、胃、肺、肠管正常；淋巴结、胰腺正常；喉头、咽喉、气管正常（图1-D、图1-H）。对照组：注射部位及器官均正常（图1-I、图 1-J）。

图1 疫苗接种组和对照组剖检结果

分别在免疫前（2周龄）、免疫后（4周龄），每组随机取20只鹅称重。结果显示，各组平均增重最大为2 225 g，最小为2 107 g（表1），无显著差异（P＞0.05）。

2.2 效力试验

免疫前后，随机取30只鹅采样检测H7和H5抗体，共采样检测7次。结果显示：免疫前，HI抗体滴度均为0；免疫后，H5、H7的HI抗体滴度逐渐上升（表2）。加强免疫后2周，H5、H7的HI抗体滴度平均值分别达到6.6 log2、6.4 log2，合格率达到了70%以上，符合国家要求（图2）。免疫前后，共采集喉头和泄殖腔棉拭子210个，由国家禽流感参考实验室对其进行H7N9病毒分离。结果均为阴性。

表1 免疫前后鹅的平均体重 单位：g

图2 抗体滴度和合格率变化曲线

3 分析与讨论

3.1 疫苗免疫是必要的

2017年2月18日，国家卫生和计划生育委员会向世界卫生组织（WHO）报告，对从广东省两病例分离的H7N9病毒株进行核酸序列分析，发现其在 HA1和 HA2之间的连接肽区有 4 个氨基酸插入[8]；2月21日，我国向世界动物卫生组织（OIE）报告，从广东省活禽市场中分离到这种病毒。研究显示，该病毒已从对禽低致病性向高致病性转化[10-11]。因此，对家禽接种 H7亚型疫苗，以高滴度抗体，阻止流感病毒在家禽体内的复制以及传播，进而阻断流感病毒由禽传染给人，是预防该亚型流感病毒流行的最有效手段[12]。

表2 疫苗临床应用检测结果

3.2 疫苗是安全的

无论是单剂量组，还是大剂量组，不管是肌肉接种，还是皮下接种，肉鹅采食、饮水及精神状况均正常；剖检未见淋巴、脏器有病理变化；喉头和泄殖腔棉拭子样品没分离出H7N9病毒。这些均说明该重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗免疫接种肉鹅是安全的。从肉鹅免疫后增重情况分析，疫苗接种组平均增重2157～2225 g，对照组平均增重2 162 g，各组间无显著差异，说明疫苗对鹅生长无影响。

3.3 疫苗是有效的

肉鹅免疫后3周，H5、H7抗体合格率分别达到93%、53%；免疫后5周（加强免疫后2周），HI抗体滴度都在5～8 log2之间，抗体整齐度好，而且H5、H7抗体合格率均为100%，说明该重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗免疫接种肉鹅是有效的。本试验为田间试验，没有进行免疫后的攻毒保护试验。但蒋文明等[13]进行的H7N9亚型流感候选疫苗株攻毒保护实验表明，该疫苗株对H7N9具有很好的攻毒保护作用。

3.4 疫苗用法与用量。

从免疫效果可看出，肌肉或颈部皮下注射免疫接种肉鹅均切实可行。对2周龄雏鹅进行首免，每只注射0.5 mL。5周龄时，以相同途径加强免疫1次，每只1.5 mL，加强免疫后2周（即7周龄），肉鹅H5、H7抗体整齐度好，抗体合格率均达到100%。需要指出的是，只进行1次免疫，免后3周时的H7抗体平均滴度仅为3.6 log2，抗体合格率为53%，达不到平均滴度4 log2以上、合格率70%以上的保护标准，因此肉鹅开展两次免疫是非常必要的。由于疫苗为油苗，没有进行滴鼻免疫实验。考虑到肌肉注射的普遍性，本试验并没有进行皮下注射试验。

4 结论

本研究使用重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗免疫商品肉鹅，通过单剂量和大剂量安全试验，未见肉鹅有不良临床反应及疫苗副反应，对生长无影响，说明疫苗安全性较好；效力试验表明，加强免疫后，H5、H7抗体合格率均可达到100%，疫苗保护效果较好。建议在2周龄时，对雏鹅进行首免，每只注射0.5 mL，5周龄时加强免疫1次，每只1.5 mL，这样可取得理想的免疫保护效果。