定点屠宰场（点）猪肉中三种主要食源性致病菌污染情况调查

邱 燕，温贵兰，张升波

（1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2. 安顺市动物卫生监督所，贵州安顺 561000）

沙门氏菌（Salmonella enteriditis）属革兰氏染色阴性的需氧及兼性厌氧菌，入侵机体后菌体裂解而产生内毒素。人或畜禽食用被沙门氏菌污染的食物或饮水后，致病菌在肠道内大量繁殖并进入血液循环造成菌血症；进入肠道和血液的致病菌在和机体的相互作用下被裂解而释放大量的内毒素，造成机体发生中毒症状[1-2]。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）O157:H7 同沙门氏菌一样属肠杆菌科、革兰氏阴性染色、兼性厌氧的一类食源性致病菌。该致病菌可粘附肠道粘膜，从而侵害肠道微绒毛。其产生的VERO毒素（VT），也称类志贺氏毒素（SLT），能够阻碍蛋白质合成，致使患病机体出现突然的剧烈腹痛、腹泻或出血性腹泻，直至死亡[3]。单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种没有芽孢的兼性厌氧革兰氏染色阳性菌，简称LM。LM是一种细胞内寄生菌，其对机体的致病性除了与入侵机体的致病菌数量有关外，还取决于机体的免疫力。孕妇、幼儿和年迈体弱者因免疫力低下易感染，产生恶心、呕吐、腹泻等中毒症状，严重者发生败血症和脑膜炎，孕妇会发生流产；健康人群感染后可出现轻微的感冒症状[4-5]。

近年来国际食品安全事故多发，食用被食源性致病菌污染的食物是其中的主要原因。沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李特菌是3种重要的食源性致病菌。据报道，日本、美国等发达国家的食物中毒事件中，40%～80%是由沙门氏菌引起的[6]；欧洲每年有超过16万人感染沙门氏菌[7]。在美国，每年有超过7万例大肠杆菌O157:H7感染患者。我国早在1988年曾报道有大肠杆菌O157:H7引起的肠道感染[8]。欧美国家曾多次发生单增李斯特菌引起的食物中毒，死亡率达30%以上[9]。

猪肉在我国居民饮食生活中占据着不可或缺的地位。受屠宰加工方式及运输条件等因素影响，猪肉从屠宰场到餐桌的过程中，会不同程度地受到微生物污染。这些微生物中可能存在沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌等致病菌。为了解本地屠宰场出场猪肉中3种食源性致病菌污染情况，进行了采样调查，为保证出场猪肉的卫生安全提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 检测样品

2016年3月6日至12日，选择10个生猪屠宰场（点），每个场（点）采集同一批次宰杀的生猪肉样5份，共50份。每份采集胴体背部、腿部或臀部肌肉约250 g，混匀，装在清洁、无污染、不渗漏的器具内，填写抽样单，冷藏运输到实验室备检[10]。采样前准备灭菌器具，按照程序到屠宰场点采样。

1.2 检测试剂

沙门氏菌测试片、大肠杆菌O157:H7测试片、李斯特菌测试板：广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司生产；缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸培养基（SC）、四硫磺酸钠煌绿培养基（TTB）、EC肉汤、山梨醇麦康凯平板（SAMAC）、改良CHRO Magar O157显色平板、PALCAM 琼脂、科玛嘉李斯特菌显色培养基、革兰氏染液、生化鉴定管等：杭州微生物试剂有限公司生产。

1.3 检测方法

1.3.1 试纸片（检测板）初筛 取25 g猪肉样品配成1:10的样品稀释液；取出检测试纸片（检测板），揭开上面的保护膜，吸取样品稀释液1 mL，均匀滴加到试纸片（检测板）上，盖上保护膜静置，待培养基凝固后，于（36±1）℃恒温培养箱培养15～24 h。用同样的方法滴加1 mL灭菌磷酸缓冲液于试纸片上做阴性对照，对照说明书查看试验结果。1.3.2 细菌分离鉴定 对快速检测初筛阳性的样本，参照国标法分别做3种细菌的分离培养与鉴定试验。根据试剂说明，提前准备好增菌液或培养基。检测步骤如下（以沙门氏菌检测为例）：（1）增菌。样品经处理后，用BPW 10倍稀释；调节恒温培养箱温度，放入培养箱培养8～18 h；取1 mL培养液，用TTB或SC 10倍稀释，放入培养箱培养8～24 h。（2）分离培养。用灭菌环取一环菌液于BS（或XLD）上划线，放入培养箱培养40～48 h（如选择XLD培养基划线培养，需培养18～24 h）。（3）生化鉴定。根据不同培养基上的沙门氏菌生长特征，挑取特征菌落于生化鉴定管恒温培养，做生化鉴定试验，对照沙门氏菌生化反应特征，判定结果[12-14]。

2 结果

2.1 分离菌在选择性培养基上的生长特征

分离菌在XLD平板上呈现黑色、带有金属光泽的圆形菌落或呈现灰白色、圆形菌落，在BS平板上呈现黑色或部分有黑色水解圈的圆形菌落，符合沙门氏菌在XLD、BS平板培养基上的形态特征（图1、图2）。分离菌株在PALCAM琼脂平板上呈现小的、圆形的、灰色或无色菌落，部分有黑色水解圈，符合李斯特菌在PALCAM琼脂平板上的形态特征（图3）。

图1 疑似沙门氏菌分离株在XLD 琼脂平板上的菌落

图2 疑似沙门氏菌分离株在BS琼脂平板上的菌落

图3 疑似李斯特菌分离株在PALCAM琼脂平板上的菌落

2.2 分离菌革兰氏染色镜检

经革兰氏染色的分离菌在10×100倍显微镜下观察，发现分离菌符合沙门氏菌（图4）、大肠杆菌O157:H7（图5）、单增李斯特菌（图6）的染色、形态、排列特征。

图4 疑似沙门氏菌分离株革兰氏染色镜检

2.3 分离菌生化鉴定

经生化鉴定，18份疑似沙门氏菌样品中，有7份与沙门氏菌生化特征相符，确定为沙门氏菌阳性。生化鉴定结果详见表1。

根据大肠杆菌O157:H7生化反应特征表进行结果鉴定，发现5份疑似大肠杆菌O157:H7样本中，只有1株菌符合大肠杆菌O157:H7生化反应特征（表2）。

图5 疑似大肠杆菌O157:H7分离株革兰氏染色镜检

图6 疑似单增李斯特氏菌分离株革兰氏染色镜检

参照李斯特菌生化反应特征表进行鉴定，发现8份疑似李斯特菌阳性菌样本中，有 5份符合单增李斯特菌的生化鉴定要求（表3）。

2.4 综合判定

综合上述结果，10个生猪定点屠宰场（点）的猪肉样品中，50份样本的沙门氏菌快速检测阳

编号 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶 结果判定斜面 底层 产气 硫化氢性率为40%。20份样本的大肠杆菌O157:H7阳性率为25%，单增李斯特菌阳性率为40%。用国标法对快速检测的阳性样本进行复检，发现沙门氏菌阳性率为14%，大肠杆菌O157:H7阳性率为5%，单增李斯特菌阳性率为25%（表4）。

表1 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶生化管内的反应及判定结果

表2 5株疑似大肠杆菌O157:H7生化反应特征

表3 8株疑似李斯特菌生化反应情况

4个屠宰点中，有3个检出沙门氏菌阳性；6个屠宰场中，有1个检出沙门氏菌阳性（表5）。由于有6个场（点）检测样品数量不足，因此大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌检测只做了4个场（点）：2个场的10份样品中，均未检出两种致病菌阳性；2个点的10份样品中，检出大肠杆菌O157:H7阳性1份，单增李斯特菌阳性5份（表6）。

表4 测试片初筛及国标法鉴定结果

表5 10个屠宰场（点）沙门氏菌检测结果

表6 4个场（点）大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌检测结果

3 分析与讨论

国内有关学者对食源性致病菌污染情况做了不少调查：洪伟彬等[1]从广东省东莞市各镇屠宰场采集的320份猪肝样品中，分离到64株沙门氏菌，阳性检出率为20%；景小金等[11]从贵州省七个地州农贸市场采集82份鲜猪肉样品进行检测，检出16株食源性致病菌。本次调查的沙门氏菌检出率为14%，大肠杆菌O157:H7 检出率为5%，单增李斯特菌检出率为25%，且2个屠宰点存在同一样本中2～3种菌均为阳性的情况。这些数据说明该地屠宰场点出场猪肉的食源性致病菌污染较为严重，尤其是小型屠宰点，其阳性检出率普遍高于屠宰场。

国标法是国际认可的检验标准，也是检验的基准方法。快速检测片含有选择性培养基及特有显色指示剂和高分子吸水凝胶。它是运用微生物测试片专有技术，做成的一次性快速检验产品，一步培养15～24 h就可确认是否带有致病菌。对比两种方法，国标法准确可靠，但检验过程费时复杂；测试片检验过程简单、快速，但特异性差，假阳性率高。因此需要尽快建立一种快速特异的检测方法。

我国颁布的《生猪屠宰检疫规程》及《生猪肉品品质检验规程》（GB/T17996-1999）没有对食源性致病菌检验做出规定。但2013年12月发布、2014年7月1日起实施的《食品中致病菌限量》（GB29921-2013），对预包装食品中的肉制品做出了限量规定，明确规定沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌3种食源性致病菌不得检出[11]。现实情况是，本地90%以上的鲜猪肉来源于当地小型屠宰场（点）。生猪在小型屠宰场（点）经简单清洗、宰杀、开膛、劈半等处理后，就被运到市场售卖，一旦发生公共卫生安全事故，很难追踪溯源。因此，需要加快推进屠宰企业转型升级，淘汰落后不规范的屠宰场（点），调整屠宰企业产能结构，实现生猪屠宰肉品商品化、品牌化。同时，加强对屠宰企业的监督检查，督促其按照行业标准生产加工，促使生猪屠宰加工行业走向健康、持续的发展道路，以确保居民吃上放心肉。

4 结论

本研究表明，本地屠宰场（点）出场猪肉的沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌3种食源性致病菌污染情况较严重，特别是小型屠宰点。这应引起监管部门的重视，加快推进屠宰企业转型升级，确保出场猪肉的食品卫生安全。本研究发现，测试片的检测阳性率高于国标法，但准确性偏低，说明测试片存在特异性差的问题。传统国标法虽然准确性高，但所需周期长，不适合用于快速检测。因此，需尽快开发一种快速特异的检测方法，用于屠宰场（点）致病菌的快速检测。