液质联用法测定水产品中红霉素残留的技术研究

朱志强 曾 智 童文羽

红霉素（Erythromycin，EM）是大环内酯类抗生素，主要应用于治疗由格兰氏阳性菌和部分格兰氏阴性菌引起的疾病。近年来，它在养殖业，包括水生生物中也得到应用。由于该药物在生物体内的代谢时间较长，因此容易产生残留。目前水产品中红霉素的残留主要用GB 29684-2013国家标准进行检测，本文在此标准的基础上进一步优化了前处理方法，提高了检测效率，并且能够达到规定的重现性和准确性。本试验通过液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS），多反应监测扫描模式（MRM）和同位素内标法定量，对草鱼、中华鳖、对虾等水产品中的红霉素进行了检测。

1 实验材料

1.1 仪器 AB QTRAP4500液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）、匀浆机、离心机、超声波清洗仪、垂直振荡器、氮吹仪等。

1.2 材料 草鱼、中华鳖、对虾等水产品，采自于养殖场和农贸市场，去皮去骨去内脏取可食部分切碎、混匀、冷冻，作为样品备用。

1.3 试剂和药品 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），德国Merck（默克）公司；正己烷（分析纯），国药集团。

表1 梯度洗脱液比例

表2 红霉素（EM）和红霉素同位素内标物的质谱参数

1.4 标准品 红霉素（EM）标准品（德国Dr公司）、红霉素同位素标准品（美国CIL氘代试剂)。

2 实验方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo C18柱（1.9μm×2.1mm×50mm）;柱温40℃；进样量10.0μL；流动相0.2%甲酸乙腈溶液和0.2%甲酸水溶液，流速0.4mL/min,运行时间10min（见表1）。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测扫描模式（MRM）；雾化器、碰撞器为氮气。质谱参数见（表2）。

3 实验步骤

3.1 标准溶液的配置

红霉素标准储备液（100.0μg/mL）用甲醇配置，红霉素标准中间工作液（0.5μg/mL）用甲醇稀释；红霉素同位素标准使用液（200.0ng/mL）用甲醇稀释。准确量取一定量的红霉素标准中间工作液，用30%的甲醇稀释成浓度为5.0ng/mL、15.0ng/mL、25.0ng/mL、35.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL的标准系列使用液，氘代红霉素的浓度均为10.0ng/mL。

3.2 样品前处理

表3 标准工作曲线

准确称量5.00g匀浆样品，置于50mL离心管中，加入200ng/mL的内标标准溶液50.0μL，加入10mL乙腈，垂直振荡1min，超声5min，然后4500转离心5min，取上清液至另一50mL离心管中，重复提取一次，合并提取液，加入15mL正己烷振荡1min，4500转离心5min，弃去正己烷，取下层溶液10mL40℃氮吹吹干，加入1.0mL30%甲醇，涡旋，再加入2mL正己烷涡旋30秒，4500转离心5min，弃去正己烷，样液经0.22μm有机滤膜过滤后，待上机分析。

表4 红霉素的添加浓度及其平均回收率的实验数据（n=3）

3.3 样品加标回收率的测定

准确称取红霉素的阴性样品5.00g，添加浓度为0.5μg/mL的红霉素使用液10μL、50μL、200μL共3组，加入浓度为200.0ng/mL的内标标准溶液50.0μL，每组3个平行样。

4 结果与讨论

4.1 红霉素的标准工作曲线

按上述色谱和质谱条件测定一系列6个质量浓度的红霉素的标准曲线，以标准物质的质量浓度与内标物的质量浓度之比为横坐标，标准物质的峰面积与内标物的峰面积之比为纵坐标，绘制标准工作曲线，线性范围为5.0～200.0ng/mL，线性方程为y=0.13798x+0.08726，线性相关系数为0.99966，定量限为1.0μg/kg（见表3）。

4.2 不同水产品中红霉素含量的检测结果（见表4）

红霉素检测的线性范围为5.0～200.0ng/mL，定量限为1.0μg/kg，在加标量为5.0μg/kg、25.0μg/kg、100.0μg/kg时，样品加标回收率均在80%～120%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10.0%（不同水产品加标量为100.0μg/kg离子质量色谱图见图1-3）。

4.3 结论

目前水产品中红霉素的残留量主要按照国家标准GB 29684-2013进行检测，此方法在实际操作中步骤较为繁琐，前处理时间较长，且存在一定的污染风险。本实验优化了前处理方法，用氮吹取代旋蒸，同时简化操作步骤，节省操作时间，且检测结果均能满足检测要求，提高了检测效率。

图1 草鱼添加100.0μg/kg离子质量色谱图

图2 中华鳖添加100.0μg/kg离子质量色谱图

图3 对虾添加100.0μg/kg离子质量色谱图