黑蒜促进血管生成作用

盛文龙,武 云,刘发生,李娟娟,靳 梦,何秋霞,韩 兵,黄金栋,韩利文,*,刘可春,*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所,山东省科学院药物筛选技术重点实验室,山东省生物检测技术工程实验室,山东济南 250103;2.莱芜裕源食品有限公司,山东莱芜 271100)

随着社会经济的发展和人口老龄化的加剧,心脑血管疾病已成为当今危害人类健康的重要疾病[1-2],其发病率、致残率和死亡率远远超过传染病和癌症,居各类疾病之首。其中缺血性心脑血管疾病具有致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多的临床特点[2]。从天然产物中发现和寻找防治缺血性心脑血管疾病的活性物质对于解决这类健康问题意义重大。缺血性心脑血管疾病由血管於塞等引起,严重时会导致心脑组织缺血、缺氧而出现组织坏死等,其致死率逐年增高。血管网络的重建是缓解缺血组织供氧的重要途径,快速而有效地促进组织血管新生,是缺血性心脑血管疾病治疗和防治的新思路。黑蒜是一种新型的大蒜类保健食品,由普通大蒜在高温、高湿环境下发生酶解和美拉德反应后而成[3]。在保有大蒜原有营养成分和独特保健功能的基础上,黑蒜中新功能成分的产生,以及原有鲜大蒜中辛辣感和刺激性气味的降低,使得黑蒜成为大家喜爱的药食兼具型新兴保健食品[4-6]。现有的文献表明,黑蒜在抗氧化[7-9]、血脂调节[10-11]等方面具有一定的生物活性。然而,黑蒜对于心血管系统疾病的防治作用还缺乏全面的科学证据。

作为重要的新型模式生物,脊椎动物斑马鱼具有体表透明可视、适合高通量、发育时间短、实验周期短、实验用药少、实验成本低、体表通透性好、具有脊椎动物大部分组织和器官、与人类基因组同源性高、基因组全系列测序已完成以及多品系转基因斑马鱼日趋成熟等诸多特点[12-14],斑马鱼已成为构建疾病模型、新药研发和药物筛选领域极富利用价值的活体生物实验模型[15-18]。鉴于斑马鱼与人类具有极为相似的早期心血管发育系统[19],以及可用于造血系统生理和病理功能研究的荧光蛋白标记血管的斑马鱼模型的构建,为促/抗血管生成药物的筛选提供了有利条件。以flk-1:GFP系转基因鱼为代表的斑马鱼模型,是采用绿色荧光蛋白标记血管内皮生长因子二型受体,借助荧光显微镜,人们能够更加直观、清楚地观察到活体斑马鱼胚胎血管发育全程,适用于考察外源性药物对斑马鱼血管生成的促进或抑制作用,从而对符合要求的促/抗血管生成药物进行筛选。此外,人脐静脉内皮细胞为血管内壁与血液间的单层细胞,在维持机体内外环境的稳定中,发挥重要的生理作用。内皮细胞的原代培养简单、有效,加之人脐静脉内皮细胞来源于人体,是体外研究心血管系统的重要资源,这使得内皮细胞成为心脑血管疾病研究的良好模型。

本实验利用斑马鱼血管生成检测实验和人脐静脉内皮细胞增殖检测实验,从体内和体外两方面考察黑蒜对于血管新生的促进作用,旨在为黑蒜价值的深入开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑蒜 莱芜裕源食品有限公司(批号20170603);绿色荧光蛋白标记血管的flk-1:GFP斑马鱼 山东省科学院斑马鱼药物筛选平台;人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 齐氏生物科技公司;DMEM/F12培养基 Hyclone公司;新鲜胎牛血清、0.25%胰酶 Gibco公司;青链霉素 上海生物工程技术服务有限公司;酪氨酸激酶抑制剂PTK787[20](又名瓦他拉尼,Vatalanib)、麻醉剂三卡因(tricaine,间氨基苯甲酸乙酯) Sigma Aldrich公司;丹红注射液 山东丹红制药有限公司;链霉蛋白酶Pronase(斑马鱼胚胎脱膜剂) Solarbio公司;细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8) Dojindo公司。

SZX16荧光显微镜、DP2-BSW图像采集系统 日本Olympus公司;斑马鱼养殖饲养设备 北京爱生科技公司;博讯SPX-300B-G型光照培养箱 上海基星生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑蒜提取液的制备 取40 g黑蒜,粉碎后加100 mL蒸馏水,80 ℃条件下提取4 h,过滤,得黑蒜提取液,4 ℃条件下避光保存,备用。

1.2.2 斑马鱼胚胎的制备与药物处理 雌雄斑马鱼成鱼在照明14 h/黑暗10 h恒温(28 ℃)条件下分开饲养。取性成熟斑马鱼进行交配并获取胚胎,对受精卵进行消毒和清洗后,加入到斑马鱼胚胎培养用水(5 mmol/L NaCl,0.17 mmol/L KCl,0.4 mmol/L CaCl2,0.16 mmol/L MgSO4)中,置于28 ℃光照培养箱中培养,待用。

取24 hpf(hours post-fertilization,受精后小时)的斑马鱼胚胎进行脱膜(幼鱼孵化前的胚胎膜)处理,随机分组并移入24孔板中,设空白对照组、血管模型组(添加0.2 μg/mL PTK787)、阳性对照组(添加30 μL/mL丹红注射液,同时添加0.2 μg/mL PTK787)和黑蒜提取液处理组(设有0.2、0.8和3.2 μL/mL的浓度梯度,同时添加0.2 μg/mL PTK787)。每隔24 h换液一次,在28 ℃光照培养箱中培养,并分别于48 hpf时通过荧光显微镜观察斑马鱼节间血管(intersegmental vessel,ISV),72 hpf时观察斑马鱼肠下静脉(subintestinalis vessel,SIV)生长情况,通过DP2-BSW图像采集系统进行数据采集。

1.2.3 人脐静脉内皮细胞增殖实验 人脐静脉内皮细胞来源于正常人脐静脉血管内膜表面,体外培养并接种于含DMEM/F12完全培养基的96孔板中,保证细胞数目约为6000个/孔,并于含有5% CO2培养箱中37 ℃温度下培养。待细胞贴壁后,分别加入受试药物,详细信息如下:空白对照组(不额外施加任何药物)、阳性对照组(4.0 μL/mL丹红注射液)和黑蒜提取液处理组(设有0.2、1.0和5.0 μL/mL的浓度梯度)。待内皮细胞生长至覆盖培养瓶底面积的60%～80%时,各组同时施加CCK-8溶液,将培养板移入培养箱中继续培养2 h后,利用分光光度计检测450 nm处细胞溶液的吸光度值,并以吸光度值的大小代表细胞活性的强弱。

1.2.4 镜检 在荧光显微镜(SZX16,Olympus)下利用FV10软件对绿色荧光蛋白标记血管的flk-1:GFP系斑马鱼ISV、SIV进行数据采集,在显微镜明场下对细胞增殖实验中各组细胞形态进行数据采集,上述数据存储于电脑中。

1.3 数据处理

通过Adobe Photoshop CS3进行图片尺寸等处理,使用OriginPro 8.0(OriginLab Corp.,Northampton,MA,USA)和Microsoft Excel(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)进行数据分析和图像制作。所有统计数据均以平均值(mean)±标准误(SE)的形式表示,其中,斑马鱼实验中,各组重复数n=8;细胞活性实验中,各组重复数n=4。统计学检验采用T-Test检验和One-way-ANOVA检验。

2 结果与分析

2.1 黑蒜提取液对斑马鱼ISV和SIV新生的促进作用

2.1.1 黑蒜提取液对斑马鱼ISV新生的促进作用 经PTK787、丹红注射液和不同浓度的黑蒜提取液处理的斑马鱼胚胎,通过荧光显微镜观察到的flk-1:GFP系转基因荧光斑马鱼胚胎ISV的生成情况如图1所示,空白对照组中ISV从腹侧背主动脉(dorsal aorta,DA)或者后主静脉(posterior cardinal vein,PCV)发出,向背侧延伸到达背侧纵向血管(dorsal longitudinal anastomotic vessels,DLAV),相邻ISV间均匀而有序的并排分布,且在拐角处生成侧枝。血管模型组中,PTK787的加入使得部分ISV仅仅长出血管芽或者ISV长度偏短,未与DLAV相连,且呈现出血管排列不规律、走向紊乱等特点。

图1 各组药物处理后斑马鱼ISV生长情况Fig.1 Angiogenesis of ISVs in zebrafish after drugs treatment注:A～F为各组斑马鱼胚胎ISV典型图,如箭头所示,其中A为空白对照组,B为血管模型组,C为阳性对照组,D～F为黑蒜提取液处理组(0.2 μL/mL(图D)、0.8 μL/mL(图E)、3.2 μL/mL(图F))。

如图2统计结果显示,PTK787处理斑马鱼24 h后,血管模型组斑马鱼ISV条数显著(p<0.05)低于空白对照组,这提示PTK787对斑马鱼ISV的发育具有明显的抑制作用。丹红注射液及黑蒜提取液的加入,能很好地改善由PTK787引起的上述血管发育不全,并且黑蒜提取液的促血管生成作用呈现出显著的剂量依赖性,带有荧光信号的ISV条数随着黑蒜提取液浓度升高而增加,当黑蒜提取液浓度增加至3.2 μL/mL时,PTK787对ISV荧光信号的抑制作用几乎消失,提示黑蒜对斑马鱼胚胎ISV的生长起到明显的促进作用。

图2 各组药物处理后斑马鱼ISV生长情况的统计Fig.2 Statistics of angiogenesis of ISVs in zebrafish after drugs treatment注:各组斑马鱼胚胎ISV条数统计图;*p<0.05对应于空白对照组与血管模型组,#p<0.05对应于给药组(阳性对照组或者黑蒜提取液处理组)与血管模型组。

2.1.2 黑蒜提取液对斑马鱼SIV新生的促进作用 经血管生成抑制剂PTK787、丹红注射液和不同浓度的黑蒜提取液处理的斑马鱼胚胎,由荧光显微镜观察并分析flk-1:GFP系转基因荧光斑马鱼胚胎SIV的生成情况如图3所示。72 hpf时,空白对照组典型SIV呈整齐的栅栏状,连续无分枝。血管模型组斑马鱼SIV产生畸形,带有荧光的血管几乎完全消失。

图3 各组药物处理后斑马鱼SIV生长情况Fig.3 Angiogenesis of SIVs in zebrafish after drugs treatment注:A～F为各组斑马鱼胚胎SIV典型图,如箭头所示,其中A为空白对照组,B为血管模型组,C为阳性对照组,D～F为黑蒜提取液处理组(0.2 μL/mL(图D)、0.8 μL/mL(图E)、3.2 μL/mL(图F))。

如图4统计结果显示,PTK787处理斑马鱼48 h后,该血管模型组斑马鱼SIV条数显著低于空白对照组(p<0.05),这提示PTK787对斑马鱼SIV的发育有着明显的抑制作用。而经丹红注射液和不同浓度黑蒜提取液的额外处理后,带有荧光信号的斑马鱼SIV的生长呈现出较好的恢复状态,并且黑蒜提取液的促SIV生成作用呈现出明显的剂量依赖性,SIV条数随着黑蒜提取液浓度升高而增加,当黑蒜提取液浓度增加至3.2 μL/mL时,PTK787对SIV的生成抑制作用几乎消失,这提示黑蒜可促进斑马鱼SIV的再生,也说明黑蒜提取液的促心血管生成作用广泛存在于斑马鱼心血管系统。

图4 各组药物处理后斑马鱼SIV生长情况的统计Fig.4 Statistics of angiogenesis of SIVs in zebrafish after drugs treatment注:各组斑马鱼胚胎SIV条数统计图,*p<0.05对应于空白对照组与血管模型组,#p<0.05对应于给药组(阳性对照组或者黑蒜提取液处理组)与血管模型组。

2.2 黑蒜提取液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

内皮细胞增殖检测实验如图5所示,内皮细胞贴壁生长,胞体为扁平多角形或梭形,呈铺路石状相互嵌合,边界清晰。

图5 黑蒜提取液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响Fig.5 Effects of black garlic extract on proliferation of HUVECs 注:A-E分别为人脐静脉内皮细胞的典型生长图,A为空白对照组,B为阳性对照组,C-E为黑蒜提取液处理组(0.2 μL/mL(图C)、1.0 μL/mL(图D)、5.0 μL/mL(图E))。

如图6所示,相较于空白对照组,阳性对照组中丹红注射液可显著促进脐静脉内皮细胞的生长(p<0.05),增加内皮细胞数目及其活性。较低浓度的黑蒜提取液(0.2 μL/mL)作用下,内皮细胞活性稍有下降,但与空白对照组无显著性差异(p>0.05);中浓度的黑蒜提取液(1.0 μL/mL)作用下,内皮细胞活性有增强趋势,但与空白对照组仍无显著性差异(p>0.05);高浓度的黑蒜提取液(5.0 μL/mL)作用下,内皮细胞活性显著高于空白对照组(其吸光度呈现出明显的统计学差异,p<0.05)。且随着黑蒜提取液使用浓度的提高,内皮细胞密度变大,活性增强,呈现出一定的剂量依赖性,这提示黑蒜对人脐静脉内皮细胞的生长起到一定的促进作用。

图6 黑蒜提取液对人脐静脉内皮细胞增殖影响的统计Fig.6 Statistics of proliferation of HUVECs by black garlic extract注:经CCK-8试剂盒处理后测得的各组细胞溶液的吸光度统计图。*p<0.05对应于阳性对照组与空白对照组,#p<0.05对应于黑蒜提取液处理组与空白对照组。

3 讨论与结论

已有的研究显示,黑蒜提取液可能通过减轻大鼠中性粒细胞浸润、抑制脂质过氧化等机制,进而增加心肌缺血再灌注的保护作用[21];而Cheol等[22]研究发现黑蒜己烷提取物能显著降低白血病细胞U937的细胞增殖,促进心血管系统的发挥正常的生理作用。大蒜类食品对心脑血管疾病等有较好的防治功能[23]已是学术界普遍认可的观点,而黑蒜在替代大蒜作为药食兼用的保健品中所拥有的多项优势[3-6],使得研究黑蒜的心血管保护作用变得愈发重要。本实验通过体内和体外实验对黑蒜的促进血管生成作用进行研究,根据荧光标记的flk-1:GFP系转基因斑马鱼血管生成实验,PTK787可以显著减少ISV的数目(p<0.05),导致ISV发育畸形,而黑蒜提取液可显著改善该模型中ISV发育畸形的问题,且带有荧光信号的ISV条数随着黑蒜提取液浓度升高而增加,表明黑蒜提取液的促血管再生作用呈现出显著的剂量依赖性。同样,黑蒜提取液在促进SIV的生成中呈现出明显的浓度依赖性,这表明黑蒜的促心血管生成作用广泛存在于斑马鱼心血管系统。另一方面,体外实验中,利用人脐静脉内皮细胞研究黑蒜提取液的促血管生成作用,黑蒜提取液可显著增加细胞密度(p<0.05),增强细胞活性,并呈现出一定的剂量依赖性,这提示黑蒜或许同样促进包括人在内的哺乳动物血管的生成作用,再次为黑蒜促进血管生成提供了科学依据。而以血管内皮生长因子Ⅱ型受体Flk-1标记血管的flk-1:GFP系转基因斑马鱼则提示黑蒜促进血管新生的机制可能与血管内皮生长因子及其受体有关。鉴于此,黑蒜作为新兴产品,有待开发成为一类防治心血管系统疾病的药食兼备的保健品。