翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠血脂代谢紊乱及肝脏脂质积累的改善作用

杜 杰

(山西大学体育学院,山西太原 030006)

近年来,随着经济的发展和人们生活水平的提高,高脂肪食物越来越多地出现在人们的餐桌上,造成人体脂肪摄入过量。大量研究表明,高脂肪饮食可诱发机体出现高血脂症状,而血脂紊乱是高血压、动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病发生的重要诱因[1-2]。不仅如此,血液中脂质物质含量升高也会导致肝脏脂质代谢紊乱,过量的脂肪积累在肝脏中引起肝脏组织变性,如不加以控制会进一步发展成肝脏疾病[3-4]。因此,调节机体脂质代谢平衡具有十分重要的意义。

国际上推荐预防脂质代谢紊乱及相关疾病的方法为生活方式的改变(如饮食习惯,作息习惯,规律运动等)[4,18],其中,中强度有氧运动是公认的调节脂代谢紊乱的有效手段之一[10]。然而人们往往苦于找不到合适的食物以及运动方案,从而达不到预期效果;或是一味地注重饮食忽略运动的重要性,形成多坐少动的生活方式。翅果油是翅果油树种仁经过加工制成的淡黄色透明油状液体,为第四纪冰川作用后残遗下来的资源,富含不饱和脂肪酸、维生素E及植物甾醇等营养成分[5],具有降血脂、抗氧化、预防心血管疾病等功效[7-9],已经被我国批准为新资源食品[6]。目前有关膳食翅果油联合中强度有氧运动改善高脂饮食引发的脂代谢紊乱及脂质积累方面的研究还未见报道。

本实验对C57BL/6小鼠给以高脂饮食诱导血脂升高及肝脏脂肪变性,考察翅果油联合有氧运动对高脂饮食诱导的血脂代谢紊乱和肝脏脂肪积累的改善作用,为饮食与运动相结合改善高脂饮食诱发的相关疾病的研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

翅果油 超临界二氧化碳萃取所得,山西琪尔康翅果生物制品有限公司;雄性C57BL/6小鼠 SPF级,40只,4周龄,平均体重为(15.32+1.58) g,南京君科生物工程有限公司(许可证号为 SCXK(苏)2016-0010)。小鼠分笼饲养,给以12 h光照,12 h黑暗,室内温度为20～26 ℃,湿度为40%～60%;普通动物饲料 山西省医科大学动物实验中心;动物45% kcal高脂饲料(配方:酪蛋白23.30%,胱氨0.35%,玉米淀粉8.50%,麦芽糊精11.65%,蔗糖20.14%,纤维素5.83%,豆油2.91%,猪油20.68%,复合矿物质1.17%,磷酸氢钙1.51%,碳酸钙0.64%,柠檬酸钾1.92%,复合维生素1.17%酒石酸氢胆碱0.23%) 北京科澳协力饲料有限公司;总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)酶学试剂盒 南京建成生物科技有限公司。

ZS-PT型动物实验跑台 北京众实迪;KDC-140HR型高速冷冻离心机 中科中佳科学仪器有限公司;DW-86L959型超低温冰箱 海尔生物医疗;Spectra Max190型酶标仪 美国分子仪器;JXFSTPRP-I-02型组织匀浆仪 上海净信实业发展有限公司;Leica Rm2235型组织切片机 德国莱卡;BME500型生物显微镜 欧普林光电设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物饲养及分组 小鼠适应喂养1周后,随机分为正常对照组(NC)、高脂饮食组(HF)、高脂饮食+翅果油灌胃组(HS)、高脂饮食+有氧运动组(HE)、高脂饮食+翅果油+有氧运动组(SE),每组8只,共喂养8周。正常组饲喂普通饲料,高脂饮食组饲喂高脂饲料,HS组在饲喂高脂饲料的同时每天早8点灌胃0.5 mg/g体重的翅果油,HE组在饲喂高脂饲料的同时每天上午10:00进行60 min中等强度有氧运动(按照Fernando等[11]方案,以10 m/min适应性跑步1周后,以12 m/min恒速跑步60 min),SE组在饲喂高脂饲料的同时每天灌胃翅果油及进行有氧运动。喂养期间,小鼠自由饮水,每3 d更换一次垫料,每周称一次体重。

1.2.2 取材 小鼠喂养结束,禁食不禁水12 h,采用2%戊巴比妥钠溶液麻醉,摘眼球取血,于3500 r/min,4 ℃离心20 min,分离血清,转移到EP管中置于-20 ℃保存备用;小心摘取动物肝脏,用生理盐水清洗,吸水纸吸取表面水分后称重,并将动物肝脏一分为二,一部分迅速置于液氮中冷冻,用于检测肝脏中TC、TG含量,一部分置于10%甲醛溶液中固定,用于肝组织形态观察实验。

1.2.3 血清指标检测 小鼠血清脂质指标TC、TG、LDL-C和HDL-C含量按照酶联免疫试剂盒说明书的操作进行检测,并按照以下公式计算动脉粥样硬化指数(AI)。

其中,CTC为血清TC浓度,mmol/L;CHDL-C为血清HDL-C浓度,mmol/L。

1.2.4 肝组织指标检测 取0.1 g冷冻肝脏,切碎,于匀浆机中低温匀浆,3500 r/min,4 ℃离心20 min,收集上清液,按照酶学试剂盒说明书测定肝脏组织TC和TG含量。

1.2.5 肝脏组织形态学检测 取一小块固定好的肝脏组织,按照以下步骤进行苏木精和伊红(H&E)染色。

脱水透明:肝脏组织分别置于不同浓度的酒精溶液中进行梯度脱水,再采用二甲苯透明处理45 min两次;

包埋修快:透明处理的肝组织置于包埋盒中进行石蜡包埋,凝固后修块;

制片:将修好的组织蜡块置于组织切片机上切成6 μm的薄片,38 ℃水浴锅中展开,贴于粘附载玻片上50 ℃烘干;

脱蜡:将制好的片依次在二甲苯中脱蜡20 min,梯度酒精浸泡5 min,蒸馏水浸泡5 min;

染色封片:苏木精染色7 min,伊红染色30 s,0.01%盐酸酒精分色30 s,45 ℃水浴反蓝 5 min,二甲苯浸泡两次,每次5 min,中性树脂封片；

组织观察:将制好的切片置于光学显微镜下观察肝脏组织病理形态并拍照。根据Kleiner等[12]方法对肝脏脂肪变性进行评分，肝脏脂肪变性评分如下:肝脏脂肪变性程度<5%,计0分;5%≤肝脏脂肪变性程度在≤33%,计1分;34%≤肝脏脂肪变性程度在≤66%,计2分;肝脏脂肪变性程度>66%,计3分。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠体重的影响

各组小鼠在实验期间体重的变化情况如图1所,由结果可以看出,各组小鼠起始体重不具有显著性差异(p>0.05)。经过8周的喂养,HF组小鼠体重显著高于NC组(p<0.05);当实验小鼠给予翅果油干预后,相比高脂饮食组(HF),HS组小鼠体重显著降低10.64%(p<0.05),但仍与NC组体重具有显著性的差异(p<0.05);经过有氧运动和翅果油联合有氧运动的干预后,与HF组相比,HE和SE组小鼠体重分别降低18.73%和16.10%(p<0.05),基本达到正常喂养水平。

图1 小鼠体重增长曲线Fig.1 Body weight gain curve of mice

2.2 翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠血清脂质指标的影响

各组小鼠在实验期间血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的变化如图2所示,由结果可以看出,经过8周的喂养,相比NC组,高脂饮食组小鼠的血清TG、TC、LDL-C分别显著升高了68.47%、92.89%、332%(p<0.05),血清HDL-C水平下降了24.88%,说明高脂饮食可以诱发机体脂质代谢紊乱,出现高血脂症状。经翅果油、有氧运动及联合干预后,相比高脂饮食组(HF),HS、HE和SE组小鼠血脂TG、TC和LDL-C水平发生不同程度的降低(p<0.05),其中HS、HE和SE三组小鼠血清TG与NC组不具有显著性差异(p>0.05),HE和SE小鼠血清TC也能降低到正常水平(p>0.05),SE组还能将LDL-C水平降低到正常水平(p>0.05),说明翅果油、有氧运动及联合干预均能在一定程度上有效降低高脂饮食引起的血脂升高,改善血脂代谢紊乱,且联合干预效果优于单独干预。

图2 翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠血脂及AI值的影响Fig.2 Effects of samara oil and aerobic exercise on serum lipids and AI of high-fat diet mice注:小写字母不同表示组间差异显著(p<0.05);图3，图5同。

高血脂是引起动脉粥样硬化的危险因素,一般使用AI值评价引起动脉粥样硬化的风险,由图2可以看出,经过高脂饮食后,HF组小鼠相比NC组AI值显著升高了4.22倍(p<0.05),而经过翅果油、有氧运动及联合干预后,AI值分别显著下降了27.30%、57.05%、65.41%(p<0.05),说明这3种干预均能在一定程度上降低由高脂饮食诱发的动脉粥样硬化的风险,且联合干预效果更好。

2.3 翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠肝脏指数的影响

肝脏是脂质代谢的主要器官,机体一旦出现脂代谢紊乱就会对肝脏产生一定的危害,其最直观的指标就是肝脏指数。由表1的结果可以看出,相比正常饮食的小鼠,HF组小鼠在经过8周的高脂喂养后,肝指数显著升高(p<0.05),说明高脂饮食能诱导肝脏发生一定的病变,可能出现肝脏肿大,充血,炎症,增生等症状[11]。经过翅果油、有氧运动和联合干预后,各组小鼠肝重和肝指数相比HF组均显著下降(p<0.05),并且数值与NC组不具有显著性差异(p>0.05),说明三种干预均有利于改善高脂引发的肝脏损害。

表1 翅果油联合有氧运动对小鼠肝重和肝脏指数的影响Table 1 Effects of samara oil and aerobic exercise on liver weight and liver index of high-fat diet mice

2.4 翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠肝脏脂质指标的影响

各组小鼠在实验期间肝脏TG和TC的变化如图3所示,由结果可以看出,经过8周的喂养,HF组小鼠肝脏TG和TC水平相比NC组显著升高了101.19%、89.75%(p>0.05),说明高脂饮食可能诱导肝脏脂质的积累。经翅果油、有氧运动及联合干预后,相比高脂饮食组,HS、HE和SE组小鼠肝脏TG和TC水平显著降低(p<0.05),且HE和SE组小鼠TG和TC含量与正常饮食组无显著差异(p>0.05),说明翅果油、有氧运动及联合干预对高脂饮食诱导的肝脏脂质积累具有一定的改善作用,从改善程度上看,联合干预效果优于单独干预。

图3 翅果油联合有氧运动对高脂饮食小鼠肝脏TC和TG的影响Fig.3 Effects of samara oil and aerobic exercise on hepatic TC and TG of high-fat diet mice

2.5 翅果油联合有氧运动对小鼠肝脏组织的影响

各组小鼠肝脏组织石蜡切片H&E染色及肝脏脂肪变性得分如图4、图5所示,由结果可以看出,正常喂养组小鼠肝脏细胞处于正常形态,肝小叶结构清晰,肝板分界明显,大致呈放射状,肝板之间清晰可见肝血窦,肝细胞大小正常,核大而圆,居于肝细胞中央。高脂饮食组小鼠肝脏组织发生一定程度的脂肪变性,肝小叶不清晰,肝板分界不明显,排列紊乱,肝血窦受压变窄,肝细胞体积增大,大小不一,细胞核偏离中央,胞浆内出现大量脂肪空泡。经翅果油干预后,肝组织脂肪变性得到明显的改善,胞浆内的脂肪空泡明显变小、减少,一部分肝细胞形态恢复到正常形态;经过有氧运动干预后,肝组织变性得到一定程度的恢复,肝板分界明显,肝血窦清晰,部分肝细胞形态恢复正常,胞浆内有少量小的脂肪空泡。类似地,经翅果油和有氧运动联合干预后,肝组织变性得到很大程度的恢复,肝板分界明显,排列整齐,肝血窦清晰可见,大部分肝细胞恢复到正常状态,细胞核处于细胞中央,未见脂肪空泡。

图4 肝脏组织H&E染色(200×)Fig.4 H&E staining of liver tissues(200×)

图5 肝脏脂肪变性评价Fig.5 Hepatic steatosis grade

3 讨论

大量研究发现,过量膳食高脂食物可引起机体脂肪代谢紊乱,导致机体血脂异常,长期膳食高脂会增加动脉粥样硬化及非酒精性脂肪肝发生的风险[13-14]。本实验以高脂饲料饲喂C57BL/6小鼠8周后,小鼠体重、血脂水平、肝脏系数、肝脏脂质水平都发生了显著的升高(p<0.05),并出现了一定程度的肝脏脂肪变性。

据文献报道,翅果油富含90%以上不饱和脂肪酸,植物甾醇,维生素E等,且居民熬油食用历史悠久,具有很好的调节脂代谢平衡、抗氧化、预防心血管疾病等功效[5-9]。陈雨娜[7]比较了膳食翅果油和花生油对正常饮食昆明小鼠抗氧化能力和脂质代谢的影响,结果表明翅果油能有效提高抗氧化能力以及降低血清TC、TG和LDL-C水平。类似地,黄玲等[8]比较了膳食色拉油、VE和翅果油对老龄鼠血清和肝脏抗氧化能力,结果发现相比膳食色拉油,VE和翅果油能显著降低血清和肝脏MDA含量,增加GSH-Px酶活性,说明翅果油具有很好的抗氧化能力。白谊涵等[9]考察了服用翅果油对高血脂患者血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的影响,发现相比未服用的患者,服用翅果油能有效降低高血脂患者血脂水平。从已有报道可以看出,翅果油调节脂质代谢的能力已被证实,然而研究尚处于起步阶段,且还未见有翅果油对高脂饮食诱发的脂代谢紊乱和脂质积累方面的研究。此外国内外公认的改善机体代谢平衡的方法是中强度有规律的有氧运动[10],有氧运动通过增加能量消耗,改善骨骼脂质氧化,减少体内过多脂肪堆积,从而有效改善血液脂质水平紊乱[15-16]。研究发现,有氧运动在消耗多余能量时,可能通过上调β-氧化产生乙酰辅酶A,上调偶联蛋白-1和过氧化物酶增殖物激活的受体C,导致脂肪组织的脂解,从而减轻体内脂肪的堆积,降低体重及改善机体代谢平衡[17-18]。本实验在喂食高脂饲料的同时给以翅果油、有氧运动及翅果油和有氧运动联合干预,结果发现3种干预方法均能显著降低高脂饮食引起的体重增加、血脂水平升高及动脉粥样硬化发生的风险,其中效果最突出的是翅果油和有氧运动联合干预,不仅能使体重降低到正常水平,还可使血清TC、TG和LDL-C降低到正常水平,其次是有氧运动,翅果油干预,说明通过饮食的改变结合有规律的运动能够有效改善高脂膳食引起的脂代谢紊乱。

过多脂肪的摄入加大了肝脏组织对脂质的摄取,破坏肝脏脂代谢平衡,多余的脂质以脂滴的形式在肝脏堆积,引起肝组织脂肪变性[19]。从本实验的结果可以看出,高脂饮食组肝脏TG、TC含量显著升高,肝组织H&E染色出现明显的脂肪变性。从脂肪的消化、吸收、利用的途径可以发现,血液中脂质水平的升高致使肝脏、脂肪组织对脂质的摄入增加,同时脂肪组织过多积累脂肪后还会向血液中释放游离脂肪酸,导致血液中游离脂肪酸的水平加大[20];脂肪酸通过门静脉直接进入肝脏进行合成、转运及氧化利用[21];并且过多脂肪的摄入上调SREBP-1c的表达,促进脂肪合成,阻碍脂肪氧化途径,从而导致肝脏脂质的堆积[22]。研究发现,中强度有氧运动可通过调节肝脏脂肪合成和脂肪酸β-氧化来改善肝脏脂质代谢[10]。本研究也发现翅果油、有氧运动和联合干预后肝脏脂质水平及脂质堆积得到了明显的改善,其中翅果油和有氧运动联合干预的作用效果更为明显,其次是有氧运动证实了运动在改善肝脏脂质代谢中所起到的重要作用,以及运动和饮食相结合所起到的叠加效应,然而联合干预是如何改善高脂诱发的血脂代谢紊乱和脂质积累的机制还有待进一步研究。

4 结论

翅果油、有氧运动和翅果油联合有氧运动干预能够显著降低高脂饮食引起的体重增加(p<0.05),血清TG、TC、LDL-C水平的升高(p<0.05),以及降低肝脏TG、TC的堆积(p<0.05),减轻肝脏脂肪变性程度,其中翅果油联合有氧运动干预效果优于翅果油、有氧运动单独干预效果,说明通过摄入翅果油结合有规律的有氧运动对预防高血脂、动脉粥样硬化及脂肪肝的发生具有一定的作用。