芥子碱降解菌对肉种鸡产蛋性能和免疫功能的影响

余 丹，李 斌，屈 东，邹成义，汪林书

(1.四川省畜牧科学研究院饲料研究所，四川 成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

【研究意义】芥子碱是菜籽粕等十字花科类饲料中主要抗营养因子之一，也是诱发畜禽发生鱼腥味综合征[1]的主要前体物质，严重影响畜禽生产及产品品质。【前人研究进展】目前，芥子碱降解微生物的研究主要集中在真菌上[2-3]，但降解效果不稳定、效率不高，也未见这些微生物安全性评价报道。相对于真菌，细菌的基因简单，代谢旺盛，繁殖速度快，更有利于商业化生产，因此筛选安全高效的芥子碱降解菌，应用前景更加广阔，但关于细菌对芥子碱降解的报道极少。本项目组着眼于细菌对芥子碱降解的优势，经过长期大量筛选，已成功分离培养出了一些芥子碱降解优势细菌[4]，这些细菌来源广泛、培养条件简单，对芥子碱的降解能力强，但它们对动物机体会产生何种影响，目前还未见报道。【本研究切入点】本研究拟考察项目组前期分离培养的一株鸡源芥子碱降解菌1(sinapine degrading bacteria 1,SDB1)对肉种鸡产蛋性能和免疫功能的影响。【拟解决的关键问题】为该菌株进一步应用研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验腹腔注射用SDB1菌株为本实验室前期从肉种鸡肠道中分离培养获得的芥子碱降解优势菌。

1.2 动物与试验设计

本试验在四川省畜牧科学研究院简阳实验基地进行。将324只50周龄健康肉种鸡预饲1周后，平均分成6个组。组1：一次性腹腔注射1 mL生理盐水；组2～6分别一次性腹腔注射1 mL浓度为106、107、108、109、1010CFU/mL的SDB1菌液，每个组6个重复，每个重复9只鸡。试验鸡喂养14 d。试验鸡采用3层阶梯式笼养，每笼3只鸡。平均每只鸡每天饲喂125 g同一基础饲粮。基础饲粮配方参照NRC(1994)和中华人民共和国农业行业标准——鸡饲养标准(2004)结合生产实际配制，如表1所示。营养水平除代谢能为计算值外，其余均为实测值。

1.3 样品收集和指标测定

试验结束后，以重复为单位，每天记录试验鸡的产蛋量、蛋重，计算每个重复的平均产蛋率和蛋重。试验结束时，以重复为单位称重，每个重复选一只接近平均体重的试验鸡翅静脉采血8 mL，分别制备血清和抗凝全血。采用酶联免疫法测定血清免疫球蛋白M (Immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、分泌型免疫球蛋白A (Secreted immunoglobulin A，sIgA)、白细胞介素1(Interleukin 1，IL-1)、白细胞介素2(Interleukin 2，IL-2)、γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、补体C3(Complement 3，C3)、补体C4(Complement 4，C4)水平，试剂盒购自南京建成赛浩科技有限公司；采用流式细胞仪测定外周血CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴细胞比例。

表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)

注：1)预混料为每1 kg饲料提供：铁80.00 mg，铜8.00 mg，锰100.00 mg，锌80.00 mg，碘0.90 mg，硒0.3 mg；2)预混料为每1 kg饲料提供：VA 16000.00 IU，VD 4800.00 IU，VE 60.00 IU，VK3 6.00 mg，VB1 6.00 mg，VB2 16.00 mg，VB12 0.04 mg，叶酸2.80 mg，生物素0.24 mg，烟酸 68.00 mg，D-泛酸21.60 mg。

表2 腹腔注射SDB1对肉种鸡产蛋性能的影响

注：同行肩标无字母或有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。 Note: In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01). The same as below.

1.4 统计分析

原始数据用Excel 2010进行整理，采用IBM SPSS Statistics 22对数据进行统计分析，采用one-way ANOVA法对数据进行方差分析，采用LSD法对差异显著的结果进行多重比较，各组间数据差异显著水平为P<0.05。结果采用平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 SDB1对肉种鸡产蛋性能的影响

如表2所示，预饲期各组间产蛋率差异均不显著，正试期SDB1的剂量对肉种鸡产蛋率有显著影响(P<0.05)，其中组3产蛋率最高，显著高于组4(P<0.05)，极显著高于组5(P<0.01)和组6(P<0.01)，而组6产蛋率是最低的。组1的产蛋率与其余各组之间差异不显著(P>0.05)，但在数值上低于组2和组3。无论预饲期还是正试期，各组之间蛋重差异均不显著(P>0.05)。

2.2 SDB1对肉种鸡免疫球蛋白的影响

如表3所示，腹腔注射SDB1对肉种鸡血清IgM水平有极显著(P<0.01)的影响。其中，组3的IgM水平最低，极显著低于组2、组4和组5 (P<0.01)。SDB1对肉种鸡血清IgG和sIgA水平的影响没有达到显著水平((P>0.05)，但组6的IgG水平在数值上最高，为组2的4.43倍；组5的sIgA水平在数值上最高，为组3的2.76倍。

2.3 SDB1对肉种鸡外周血淋巴细胞比例的影响

如表4所示，腹腔注射SDB1对肉种鸡外周血CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴细胞比例没有显著影响(P>0.05)。各组CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+水平差异不显著(P>0.05)，但从数值上看，组1的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+均最高。

2.4 SDB1对肉种鸡细胞因子的影响

如表5所示，腹腔注射SDB1对肉种鸡血清IFN-γ水平的影响没有达到显著水平(P>0.05)，但组5的IFN-γ在数值上最高，分别比组1和组3高55.97 %和50.40 %，组4的IFN-γ比组1高52.97 %。腹腔注射SDB1对肉种鸡血清IL-1和IL-2水平有显著影响(P<0.05)，其中组5和组6的IL-1水平显著高于组2和组3(P<0.05)；而组6的IL-2水平显著高于除组5外的所有组(P<0.05)，极显著高于组1(P<0.01)；组5的IL-2水平显著高于组1、组3和组4(P<0.05)。细胞因子随剂量的变化规律也呈现出与产蛋性能相反的趋势。

表3 腹腔注射SDB1对肉种鸡血清免疫球蛋白的影响

表4 腹腔注射SDB1对肉种鸡外周血淋巴细胞比例的影响

表5 腹腔注射SDB1对肉种鸡血清部分细胞因子的影响

表6 腹腔注射SDB1对肉种鸡血清补体C3和C4的影响

2.5 SDB1对肉种鸡血清补体C3和C4的影响

如表6所示，腹腔注射SDB1对肉种鸡血清补体C3和C4的影响没有达到显著水平显著影响 (P>0.05)，但组5的C3水平最高，分别比组1和组4高59.92 %和60.01 %。

3 讨 论

SDB1是本项目组前期分离培养的一株芥子碱降解优势菌，能在体外有效降解芥子碱，但它对动物机体有何直接影响，目前还不清楚。本文研究了一次性腹腔注射SDB1对肉种鸡产蛋性能和免疫功能的影响，结果腹腔注射低剂量SDB1(≤107CFU/mL)显著提高了肉种鸡的产蛋率。前人在凝结芽孢杆菌上的研究也得到类似结果[5]。本研究中，腹腔注射高剂量SDB1(>108CFU/mL)对肉种鸡产蛋性能产生了不良影响，这与Marcq等[6]研究结果相似。但向峰等[7]指出益生菌(0.2 %的浓度≥2×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌和0.02 %的浓度≥1×1010CFU/mL的屎肠球菌)对泰和乌鸡的生长性能也没有显著影响，这些研究使用的微生物剂量范围与本研究组4的数量级一致，结果也类似，说明微生物对动物生产性能的影响与其剂量密切相关。

动物生产性能是机体免疫状态的外在体现。机体对外来物质免疫应答的表现形式主要是以B细胞介导的体液免疫和以T细胞介导的细胞免疫。反映体液免疫功能指标最主要的是IgM、IgG、IgA等免疫球蛋白。IgM是初次体液免疫反应产生最早的免疫球蛋白，具有杀菌、溶菌、溶血、促进吞噬及凝集的作用；IgG是介导体液免疫的主要抗体；IgA分为血清型和分泌型，其中分泌型的sIgA是机体黏膜免疫的一道屏障，具有抗菌、抗病毒、抗毒素的免疫学活性[8]。本研究中低剂量组(≤107CFU/mL)免疫球蛋白水平普遍较低，而高剂量组(≥108CFU/mL)免疫球蛋白水平较高。这说明腹腔注射大于107CFU/mL的SDB1才能有效刺激肉种鸡的体液免疫系统。目前微生物对动物体液免疫系统的影响研究报道较多，普遍的结果是有益菌能增强机体免疫功能而有害菌会降低机体免疫功能。Salim等[9]的研究指出：与对照组和抗生素组相比，在肉鸡饲料中添加0.1 %的罗伊氏乳杆菌或乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的混合物，可以显著提高肉鸡IgA、IgG、IgM水平，且添加乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的混合物的效果优于单独添加罗伊氏乳杆菌。任贵强[10]等研究指出给小鼠饲喂不同剂量的两种乳酸杆菌，结果低、中剂量组血清IgG水平随着饲喂时间不断增加，有超过高剂量组的趋势。本研究的结果表明了SDB1能有效刺激肉种鸡以IgM为主的体液免疫功能，这与上述有益菌的试验结果相似，具体作用效果的差异可能与剂量有关。

细胞免疫是指T细胞受到抗原刺激转化为致敏T细胞，致敏T细胞及其所释放的细胞因子对再次进入的抗原的直接杀伤和协同杀伤作用[8]。根据T细胞表面抗原的差异，可将T细胞分为CD4+和CD8+两个亚群，前者具有辅助性T细胞的功能，主要包括CD2+、CD3+、CD4+、CD8-；后者具有抑制性和杀伤性或细胞毒性T细胞的功能，主要包括CD2+、CD3+、CD4-、CD8+。本研究结果显示腹腔注射SDB1后，肉种鸡外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞比例没有显著变化，说明SDB1对肉种鸡细胞免疫功能没有显著影响。本研究中血液样本是在攻毒后2周采集的，出现这种结果的原因是否是T细胞表面抗原的初期的免疫应答已经趋于平稳，或者是原本就从未产生过显著的应答有待进一步研究。因此，下一步更应该从抗原应答的角度关注初始T细胞、活化T细胞和记忆T细胞等的情况。

细胞因子是免疫细胞受刺激后产生的非抗体、非补体类具有急速样性的蛋白质分子，主要包括干扰素(interferon, IFN)、白细胞介素(interleukin, IL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)等四大系列。IL-1能诱导T、B细胞活化增殖，促进T细胞对抗原的激活。IL-2具有广谱的免疫增强活性，可诱导T、B细胞增殖分化，促进细胞毒性T前体细胞分化为细胞毒性T细胞，并增强其杀伤效应。IFN-γ则对体液免疫和细胞免疫均具有很强的免疫调节作用，能通过下调转铁蛋白受体，减少细菌供铁量；诱导内源性一氧化氮生成，直接抑制细胞内细菌或增加单核巨噬细胞的溶酶体溶解细菌作用，共同消灭细菌[8]。本研究结果表明高剂量腹腔注射SDB1后2周，肉种鸡血清IL-1和IL-2水平显著增加；尽管高剂量组IFN-γ水平与低剂量组之间的差异没有达到统计学上的显著水平，但在数值上已经超过50 %，说明腹腔注射SDB1对IFN-γ也是存在影响的。由于血液样本为SDB1攻毒后2周采集的，可见，腹腔注射SDB1可持续有效的刺激肉种鸡血液中部分细胞因子。

补体是一组具有酶活性的蛋白质，是体内重要的免疫效应放大系统, 发挥机体特异性和非特异性的抗感染作用[8]。补体的激活主要有3种途径，即经典途径、旁路途径和MBL 途径。补体C3是补体系统中含量最高且起关键作用的一种成分，所有补体激活途径均需C3参与。C4是经典途径和MBL 途径的一个重要组分，但不参与旁路途径。本研究结果中，腹腔注射SDB12周后，尽管各组血清C3和C4水平差异不显著，但组5比组1和组4均高出60 %左右，因此， SDB1对C3的影响也是不可忽视的。本试验C4的水平在各组差异很小，几乎没有变化，这是免疫急性期已过，C4的释放量已经趋于平稳，还是存在其它原因，目前还不清楚，需要进一步研究。

4 结 论

SDB1是本项目组前期分离培养的一株芥子碱降解优势菌。本研究结果表明，低剂量SDB1(≤107CFU/mL)对肉种鸡产蛋性能和免疫功能没有不良影响；而高剂量SDB1(≥108CFU/mL)会显著增强肉种鸡部分体液免疫和细胞因子水平，但此免疫增强效应是以降低产蛋性能为代价。由于微生物产品的有效性与剂量、给药方式、作用时间、受试动物个体差异等因素均密切相关，若要将SDB1应用于生产实际，还需要更多的动物试验进行支撑。下一步有必要继续研究口服或拌料给予SDB1对肉种鸡的影响。