lncRNA-AB073614在U251细胞中的表达及对细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

苏龙，林涛，车海江，郭世文

(1西安交通大学第一附属医院，西安 710061；2西电集团医院)

脑胶质瘤是最常见的成人原发性脑肿瘤，约占颅内恶性肿瘤的80%[1]。脑胶质瘤根据病理组织恶性程度分为WHO Ⅰ～Ⅳ级，通常认为 Ⅰ～Ⅱ级是低级别脑胶质瘤， Ⅲ～Ⅳ级是高级别脑胶质瘤[2,3]。尽管临床上脑胶质瘤的治疗已取得一些进展，包括手术切除以及术后放化疗等，但绝大部分患者预后仍较差，尤其是胶质母细胞瘤患者，术后生存期为9～12个月，5年生存率低于10%[4～6]。而目前相关研究显示，脑胶质瘤发生发展的基本机制仍不清楚。因此，探索脑胶质瘤发病的分子机制，寻找更有效的治疗方法迫在眉睫。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个氨基酸的RNA，其不具备蛋白质编码能力，但可通过干扰mRNA剪切、降解和翻译等过程发挥作用[7,8]。现有研究[9,10]表明，lncRNA在肿瘤与正常组织中存在差异表达，且与多种肿瘤疾病的发生和进展有关，参与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡等过程。lncRNA-AB073614是新发现的一种lncRNA，其在脑胶质瘤组织中表达异常增加，且是影响脑胶质瘤患者预后的独立危险因素，但其对脑胶质瘤发生发展的作用机制仍不清楚[11,12]。本研究观察了脑胶质瘤细胞中lncRNA-AB073614表达变化及小分子干扰RNA片段(si-RNA)转染对其细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，旨在为脑胶质瘤的早期诊断和治疗寻找新的靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、仪器及试剂 脑胶质瘤细胞U251、正常星形胶质细胞NHA均购自中科院上海生命研究院；10%胎牛血清(FBS)、Opti-MEM、DMSO试剂、MTT试剂、DMEM细胞培养液均购自美国Gbico公司；胰酶消化液购自美国Hyclone公司；TRIzol、Lipofectamine2000转染试剂、AB073614引物均购自Invitrogen公司；细胞培养耗材购自BD公司；si-RNA干扰序列由Life公司提供；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel购自BD公司；7300型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 U251细胞、NHA细胞AB073614检测 U251细胞及NHA细胞培养在含10%胎牛血清、1%青霉素的DMEM培养基中，培养温度是37 ℃，CO2浓度为5%。TRIzol法提取U251、NHA细胞的总RNA，用分光光度计定量，按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cRNA，生成条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min。cDNA稀释成10倍后放于-20 ℃保存，待后续使用。选择GAPDH作为内参，结果以2-ΔΔCt表示，所有实验操作至少重复3次。用7300型荧光定量PCR仪进行扩增，AB073614引物正义链：5′-ATTTCTGCTCCTGGGTCTTAC-3′，反义链：5′-AGTGGCTTGTCTGTTAGAGTC-3′；内参GAPDH正义链：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，反义链5′- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.3 U251细胞增殖、迁移、侵袭能力检测 ①细胞转染：转染前1 d，将生长良好的U251细胞经胰酶消化离心后，取50×103个/瓶，接种于6孔板含10%FBS培养液中培养过夜，待6孔板中细胞汇合度在70%～80%时进行Opti-MEM、Lipofectamine2000介导的转染，转染6 h后更换培养基，继续48 h。以此建立细胞模型，待后续实验。②细胞增殖能力检测：采用MTT实验。将转染si-AB073614后的U251细胞、未转染的U251细胞分别接种于96孔板中培养，培养时间为0、24、48、72、96 h，培养后加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，再次放入培养箱中培养2 h，并在每个孔中加入DMSO 150 μL，轻轻震荡混匀后，用酶联免疫检测仪测定490 nm处的吸光度值，根据测量结果绘制细胞生长曲线，比较细胞的生长情况。③细胞迁移能力检测：采用细胞划痕实验。将si-AB073614处理U251细胞、未转染的U251细胞传代重悬后，分别用细胞计数仪测量细胞的浓度，计算出目前细胞总数目，将相同数目的细胞接种到35 mm的培养皿中，在其底部做好标记，可清楚识别分割区域，细胞汇合度在50%～60%，每个培养皿中培养液在2 mL即可，体积不足用培养液配平，细胞接种后在4 ℃环境下培养24 h，当细胞密度达到100%时，用200 μL枪头进行划线，使观察区域达到4～6个，划线后倒掉培养液，用PBS洗2次，洗掉悬浮的死细胞，重新加入完全培养液中培养细胞，每隔6～12 h观察伤口愈合情况，并拍摄相应的普光和荧光照片。36～48 h后结束观察。所有实验分别独立重复3次，取平均值。比较细胞迁移能力。④细胞侵袭能力检测：采用Transwell实验。实验前将基质胶置于冰盒中，保持液体状态，在Transwell小室里分别加入200 μL的DMEM并放入到温箱中进行水化1 h。铺基质胶实验中，水化后吸去200 μL的DMEM，在小室中加入基质胶与DMEM的混合液60 μL，放入温箱中培养30 min使其凝固，待基底膜干燥后，滴入单细胞悬液培养24 h，在显微镜下观察细胞穿透基底膜的数量，随机计数5个视野，取其平均值。

2 结果

2.1 U251、NHA细胞AB073614表达比较 U251、NHA细胞中AB073614表达水平分别为3.57±0.28、1.00±0.17，两者比较，P<0.05。

2.2 U251细胞增殖、侵袭、迁移能力比较 MTT实验显示，si-AB073614处理的U251细胞存活率显著低于未转染的(P<0.05)，提示敲除U251细胞内AB073614的表达后，可明显抑制脑胶质瘤细胞增殖能力(见图1A)。细胞划痕实验显示，si-AB073614处理的U251细胞迁移能力明显低于未转染的(P<0.05)，详细见图1B。Transwell实验显示，si-AB073614处理的U251细胞穿膜细胞数明显低于未转染的(P<0.05)，详见图1C。上述结果说明，抑制AB073614表达，可明显降低脑胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力。

图1 si-AB073614转染对U251细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

3 讨论

脑胶质瘤是常见的原发性颅内恶性肿瘤，在中国的发病率呈逐年上升趋势，同时因其恶性程度高、预后差，越来越受到人们的关注，急需新的治疗方法及肿瘤标记靶点用于脑胶质瘤的诊断和治疗[13,14]。以往对于脑胶质瘤的研究主要集中在与其发生发展密切相关的细胞异常分化、细胞增殖失控、细胞外基质降解、基底膜破坏等方面[15]。近年研究表明，lncRNA可参与基因组的修饰、类似ceRNA作用参与对靶基因调控、结合特异性DNA或RNA对靶基因的表达进行转录激活和转录后调控。随着对lncRNA在肿瘤发生发展中的研究越来越多，使其成为肿瘤研究的热点[16,17]。文献[18]报道，脑胶质瘤U87细胞可见lncRNA-ATB，并发现其可明显抑制脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移过程，这说明lncRNA-ATB与脑胶质瘤的发生发展关系密切。另外学者对lncRNA-MEG3、CRNDE等在脑胶质瘤中的作用也进行了深入研究[19,20]，而反观lncRNA-AB073614只是在其他恶性肿瘤组织中证实表达明显高于癌旁正常组织，且在这些肿瘤的发生发展过程中发挥重要的调节作用，但对lncRNA-AB073614在脑胶质瘤领域的研究较少[21]。

lncRNA-AB073614是一种最新发现的lncRNA，以往研究主要集中在其与结直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的关系方面。Xue等[22]对lncRNA AB073614在结直肠癌中的作用研究结果显示，在SW480和HCT116细胞中，lncRNA-AB073614敲除后显著促进了E-cadherin和Occludin蛋白表达水平，并降低了N-cadherin和Vimentin的表达，进一步降低了细胞的迁移和侵袭能力，影响结直肠癌细胞的生长。Cheng等[23]发现，在HO-8910细胞和OVCAR3细胞中，敲低AB073614表达可显著抑制细胞增殖和侵袭，导致细胞周期中G1期细胞停滞和凋亡增加，体内实验还证实敲低AB073614可抑制OVCAR3细胞增殖，AB073614在卵巢癌发育中充当功能性癌基因的作用，对肿瘤的发生发展起促进作用。研究[24]认为，lncRNA-AB073614表达SOX7抑制胃癌的发生和进展，且lncRNA-AB073614表达与胃癌的肿瘤体积、TNM分期、血管神经浸润等明显相关，因此可以作为胃癌早期诊断的重要指标。Sun等[25]发现，lncRNA-AB073614在乳腺癌的扩散、浸润发挥重要作用，通过表达SOX7和AXIN2发挥作用，两者的表达均与乳腺癌肿瘤的体积、浸润深度、淋巴结转移、临床分期等相关，影响乳腺癌癌细胞的增殖、迁移与侵袭。研究证实，AB073614在人脑胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织，且可作为预测脑胶质瘤患者预后的独立危险因素，然而对于AB073614在脑胶质瘤中的具体作用机制作者并未提及。因此，我们的研究重点是在此基础上，探讨AB073614在体外脑胶质瘤细胞中的表达以及作用。本研究显示，AB073614在神经胶质瘤细胞中呈高表达状态。本研究还显示，敲除AB073614的脑胶质瘤细胞较未转染的脑胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力明显减弱，提示敲除AB073614基因可能对肿瘤的进展具有抑制作用。

总之，U251细胞中AB073614表达升高，si-RNA转染AB073614能明显抑制其增殖、侵袭、迁移能力。