猪瘟、蓝耳、圆环、伪狂犬病毒PCR快速诊断方法的建立

杨 科 丁 宏 罗祥波 普仕华 郭兆卫 侯明省 冯德正 张书光*

（1.德宏州动物疫病预防控制中心，云南芒市 678400;2.梁河县动物疫病预防控制中心，云南梁河 679200;3.陇川县动物疫病预防控制中心，云南陇川 678700）

随着养猪业规模化和集约化方向发展，猪群常发生多病原混合感染、继发感染，其中猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪蓝耳病毒（PRRS）是较易混合感染的危害养猪业的四大病毒性疫病。近年来这四种病毒病温和型不断出现，通过临床症状、病理解剖和药物诊断往往无法做出准确的诊断，常常需要借助实验室检测才能做出确诊，而实验室检测需要组织处理、核酸提取、PCR扩增和电泳检测四大流程，四种病毒病检测下来最快需要两到三天甚至更久，使得养殖户蒙受巨大损失，因此如何在不影响灵敏度和准确度的前提下缩短检测流程已迫在眉睫。我们兽医实验室经过大量摸索，样品处理、核酸提取流程均已优化，可在半个小时内提取到总核酸，在此基础上建立起了一种单台PCR、单次PCR扩增、一次性检测猪瘟、蓝耳、圆环、伪狂犬病毒四种病原的方法。

1 材料与方法

1.1 阳性病料和引物设计、合成

阳性病料和猪瘟、蓝耳、圆环、伪狂犬病毒检测引物由云南省动物疫病预防控制中心提供。引物扩增片段大小为350bp。

1.2 仪器设备、酶和试剂盒

核酸自动提取仪NP968-S（西安天隆），震动球磨仪GT200（格瑞德曼），PCR仪（德国耶拿），Syngene凝胶成像系统（美国UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒（西安天隆），PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3 总RNA的提取

分别应用西安天隆科技有限公司生产的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒和从阳性病料（脾、肺、淋巴结）中提取总DNA/RNA，具体操作过程见说明书。

1.4 四种病毒快速诊断方法的建立

根据实验室前期的大量摸索，猪瘟、蓝耳、圆环、伪狂犬引物的最佳退火温度分别为54℃、50℃、55℃、58℃，利用梯度PCR的touchdown功能（在引物退火温度摸索过程中，每一列的温度都不相同，将四种引物的最高和最低TM值作为区间），将四种检测不同病毒核酸的体系放置于一台PCR中进行扩增，一次扩增相当于利用四台PCR同时扩增，大大缩减PCR所需时间。

2 结果

2.1 总RNA提取效果图

使用核酸自动提取仪提取法（磁珠法）提取阳性病料中的总核酸，电泳检测发现提取出了高质量的RNA，符合本实验要求。

疫苗总RNA提取效果图

2.2 四种病毒快速诊断方法的建立

3 讨论

随着养猪业规模化和集约化方向发展，猪群常发生多病原混合感染、继发感染，其中猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪蓝耳病毒（PRRS）是较易混合感染的危害养猪业的四大病毒性疫病。近年来这四种病毒病温和型不断出现，通过临床症状、病理解剖和药物诊断往往无法做出准确的诊断，常常需要借助实验室检测才能做出确诊，而实验室检测需要组织处理、核酸提取、PCR扩增和电泳检测四大流程，四种病毒病检测下来最快需要两到三天甚至更久，使得养殖户蒙受巨大损失。因此，我们建立了一种可快速准确一步法检测四种猪病的RT-PCR 技术。

目前RT-PCR检测猪病的技术主要环节为样品处理、核酸提取和稳定的检测引物三个方面。本实验将四种猪病的检测流程简化为一次PCR扩增，本来需要三天才能完成的检测一天完成，大大缩减养殖户等待检测结果的时间，可以更好地为养殖户提供诊断和治疗建议。

试验结果表明，一步法检测四种猪病的RT-PCR 技术和单独扩增方法并无区别，只是利用PCR仪的touchdown功能，将本该四次PCR扩增的步骤简化为一步完成，大大缩减检测时间，提高了监测效率，可以广泛推广使用。