小鼠胰岛结合生物胶经皮下移植治疗小鼠糖尿病的研究

王佳微，傅红兴，赵应征，杨丽斌，耿武军

（1．温州医科大学药学院，浙江 温州 325035；2．温州医科大学附属第一医院麻醉科，浙江 温州 325035）

bFGF是碱性成纤维细胞生长因子，是体内已知的作用最强的促血管生长因子[1]。本实验通过有无结合含bFGF的生物胶与胰岛细胞团共移植的比较，监测血糖和体重变化，并且通过HE染色和免疫组化染色进行组织学评价，探测bFGF在体内对小鼠胰岛微血管修复的影响及通过血管修复对于控制血糖的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

Balb/c小鼠10只，体重约22 g，由温州医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂和实验器材

Ⅴ型胶原酶（Sigma公司，美国）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL 1066培养液（温州怡康细胞移植技术开发有限公司，中国）；Hanks液（自配）；胎牛血清（四季青公司）；二乙酸荧光素（FD）（Sigma公司）；Anti-Insulin（Abcam公司）；bFGF（浙江格鲁斯特生物科技有限公司）；透明质酸钠（湖北远成赛创科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 60 ng/mL bFGF透明质酸钠胶制备

（1）精密称取20 mg透明质酸钠粉末至1支4 mL无菌的EP管中，盖子不用盖紧，将其用纱布包裹后放入灭菌盒中；（2）将其置于高温高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌时间为5～10 min；（3）将灭菌好的装有透明质酸钠粉末的EP管置于超净工作台中，向此EP管中加入2 mL 60 ng/mL bFGF细胞培养液，搅拌均匀使其成半流动性凝胶状，即得到10 mg/mL含60 ng/mL bFGF透明质酸钠胶；（4）用封口膜封口后置于4℃冰箱过夜保存，以去除配制中产生的气泡。

1.2.2 ICR小鼠皮下移植

（1）将准备移植的糖尿病小鼠在移植前20 min皮下注射50 μL头孢唑啉钠，小鼠采用持续吸入异氟烷麻醉；（2）待小鼠麻醉后，剃去腹股沟处周围毛发，暴露的皮肤用酒精擦拭消毒，用眼科剪剪开外皮，用镊子轻柔提起里面的肌肉层，剪开肌肉层后，用1 mL注射器针头在皮下轻轻刺破一个小孔，在体视显微镜下，将准备好的胰岛通过小孔缓缓注射入皮下，注射充分后缓缓拔出注射器并用镊子轻轻夹住注射部位的小孔，以防胰岛细胞溢出；（3）待出血停止后轻轻提拉肌肉层，缝合伤口，缝合时先第一针四个外科手术结固定，然后连续缝针，最后一针再与上一针进行四个外科手术结固定，剪掉多余线；（5）小鼠放回笼子，1 min左右小鼠即苏醒，整个手术过程约20 min。

1.2.3 术后消炎及血糖监测

术后每8 h皮下注射50 μL或每12 h注射100 μL头孢唑啉钠抗炎，持续一周，防止炎症因子对胰岛移植物的影响。手术后6、12、24、48 h测定血糖，之后每周测定一次血糖，直至血糖超过11.1 mmoL/L后宣告移植物失效，记录术后血糖和体重的变化。

2 结 果

2.1 移植后血糖监测结果

通过血糖变化曲线（图1）可知，加生物胶的移植组比不加生物胶的移植组起效时间持久。由体重变化曲线（图2）可知，加生物胶的移植组比不加生物胶的移植组体重增加的速率稍快。

图1 ICR小鼠皮下移植后血糖变化图

图2 ICR小鼠皮下移植后体重变化图

图3 胰岛的HE染色和免疫组化染色

2.2 HE染色和免疫组化染色结果

各实验组在移植后10天将移植部位的皮肤组织取下，通过HE染色和免疫组化来评价含bFGF生物胶移植的实验组中皮下胰岛的形态和Insulin的表达，结果如图3所示。

在结果（图3-A）HE染色中可知，胰岛数目不是很多，而且形态不是很完整。在免疫组化结果B中可看出，皮下组织存在的Insulin阳性细胞较少。

3 讨 论

本实验通过有无结合含bFGF的生物胶与胰岛共移植比较，监测血糖和体重变化，并且通过HE染色和免疫组化染色进行组织学评价，探测了bFGF在体内对小鼠胰岛皮下移植疗效的影响。通过实验可知，尽管皮下移植的疗效并不理想，胰岛可能因各种原因引起凋亡而失活[2]，但可避免在初期因血液介导的炎症反应（IBMIR）加含bFGF的生物胶的移植组血糖控制效果优于不加含bFGF的生物胶的移植组。也说明，bFGF能够改善胰岛移植的相关功能指标。