涤纶经编小口径人工血管的制备工序对其生物相容性的影响*

1.东华大学纺织学院，上海 201620；2.东华大学纺织面料技术教育部重点实验室，上海 201620

涤纶大口径纺织基人工血管已作为替代物，广泛应用于血管外科。但涤纶小口径人工血管作为移植替代物应用于人体时，往往会因为内皮细胞在材料表面内皮化的速度缓慢，从而引起内膜异常增生或形成血栓，导致血管移植后出现再狭窄、远期通畅率低等问题[1-4]。而解决这些问题的关键是提高内皮细胞在材料表面内皮化的速度。多项研究结果表明，生物材料表面的微观结构对于内皮细胞的黏附有很大的影响。就膜材料而言，材料表面的微观结构主要指表面粗糙度、孔隙率和孔径尺寸等，而纳米纤维膜材料中纳米纤维的直径也会对材料表面的微观结构造成影响。已有的针对细胞黏附的研究表明，人类和其他哺乳类动物的细胞更容易在孔径为20～125 μm的材料表面黏附和增殖，因此，通过选用微米级纱线、设计合理的组织结构、采用机织或针织工艺，可以构造出适合内皮细胞黏附的孔径尺寸。此外，相对于纳米纤维膜材料，机织或针织材料均具备一次成形且力学性能优秀等特点[5-8]。

本研究为确保人工血管既具备良好的顺应性又能满足人体对其力学性能的要求，利用生物级涤纶复丝制备管状经编织物(即管坯)，然后依次对其进行洗涤处理、紧密化处理、预波纹化处理和波纹化处理，以期提高其对细胞的相容性，并选取各道工序后的材料进行体外细胞试验，探索涤纶小口径人工血管的制备过程中，材料表面的微观结构的变化是否会对内皮细胞的黏附造成影响。利用细胞增殖及细胞黏附试验，系统评价整个制备过程中材料表面的结构对内皮细胞在其表面黏附的影响，以期获得材料的生物相容性，为后续临床试验奠定基础。

1 涤纶经编小口径人工血管的制备

选取生物级涤纶复丝为原料，采用针织经编工艺，通过调节双针床织机前后梳栉的运动织造管状经编织物(即管坯)；然后对管坯依次进行洗涤处理、紧密化处理、预波纹化处理和波纹化处理，最终制得涤纶经编小口径人工血管(图1)。表1归纳了各工序所得管状经编织物中的线圈长度及管径。将各工序所得的管状经编织物分别沿轴向剪开并裁剪出直径为1.3 cm的圆形，得到试样A～试样E共5块试样，用去离子水洗净，再采用高压蒸汽灭菌法灭菌后烘干备用。

(a) 管坯成形

(b) 洗涤处理后

(c) 紧密化处理后

(d) 预波纹化处理后

(e) 波纹化处理后

表1 各工序所得管状经编织物的线圈长度及管径

2 性能测试

2.1 红外光谱扫描

利用Nicolet 6700红外光谱仪对各工序所得管状经编织物试样进行全反射红外光谱测试，测试波数范围为600～4 000 cm-1。利用所得红外光谱图，比较分析各工序是否对试样表面的化学结构造成影响。

2.2 试验细胞的选择与准备

选取人脐静脉内皮细胞(HUVEC001，澳赛尔斯生物技术有限公司)进行细胞试验。将冻存于液氮罐中的人脐静脉内皮细胞复苏后，在37 ℃的二氧化碳培养箱中经过3次传代培养后，方可进行细胞的种植。

2.3 细胞种植

将各道工序得到的试样按照24、96、168 h的培养时间节点，摆放在3块24孔板内，每天每块试样设置3块平行样进行试验。将培养好的人脐静脉内皮细胞稀释并计数，按照每孔20 000个的人脐静脉内皮细胞浓度种植到试样上，并设置空白对照样。将细胞培养板放置在二氧化碳培养箱中，于37 ℃的条件下培养。

2.4 细胞增殖

在将人脐静脉内皮细胞培养20、92、164 h后，向24孔板的每个孔内添加40 μL细胞活性检测试剂(CCK-8试剂盒，凯基生物技术有限公司)继续培养，每块试样均设置3块平行样用于对照。再经过4 h的培养后，利用酶标仪在450 nm波长下测试吸光度。

2.5 细胞黏附

将与人脐静脉内皮细胞共同培养24、96、168 h的24孔板中的培养基吸出。由于人脐静脉内皮细胞为贴壁细胞，故不会被吸出，利用磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)清洗24孔板中的试样与细胞3次，然后使用体积分数为4%的多聚甲醛固定细胞与试样2 h；随后，将固定好的试样与细胞在体积分数为50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中依次浸泡脱水，每种酒精中均浸泡5 min；最后，将脱水后的试样在冷冻干燥机中干燥，使用EVO LS 15扫描电镜(德国卡尔蔡司公司)观察人脐静脉内皮细胞在试样表面的生长状态。

3 结果与讨论

表1的测试结果表明，在涤纶经编小口径人工血管的制备过程中：管坯成形、洗涤处理、紧密化处理后，纤维间距会逐渐减小，其中紧密化处理后线圈长度明显减小，前梳和后梳的线圈长度分别减小了22.5%和15.7%，这使得紧密化处理后的管径相比于管坯成形和洗涤处理后的明显减小(图1)，故而大大缩小了组织点间距，试样表面趋于平整；预波纹化处理后，线圈结构及纱线和单纤维的细度不均匀性改变较小，这表明此时结构已趋于稳定；波纹化处理后，前梳和后梳的线圈长度均有所增加。5道工序处理后，试样的表面微观结构发生了较大变化，且已有研究表明，试样表面结构的参数会对内皮细胞的响应产生较大的影响[9-10]。因此，本试验针对试样表面结构的变化，探究了整个制备过程中试样表面结构对于人脐静脉内皮细胞黏附的影响。

3.1 红外光谱测试

分析图2的红外光谱可知，在经过管坯成形、洗涤处理、紧密化处理、预波纹化处理和波纹化处理后，涤沦经编小口径人工血管并没有出现新的特征峰，这表明后期的工序处理没有在试样表面引入新的官能团，未造成试样表面化学结构的改变。因此可以认为，整个制备过程只改变了试样表面的物理结构，即试样表面的微观结构。

图2 各道工序处理后试样的红外测试光谱图

3.2 细胞增殖

图3的细胞增殖试验结果表明，随着人脐静脉内皮细胞培养时间的增加，人脐静脉内皮细胞在试样A～试样E表面的增殖速度随试样线圈长度的减小而提高。且由于吸光度的高低可直接反映出人脐静脉内皮细胞在试样表面的活性及增殖情况[11-12]，故基于试样A～试样E在细胞培养168 h后的吸光度可以认为，5块试样可根据细胞活性分为3组，试样A(第一组)，试样B和试样C(第二组)，试样D和试样E(第三组)，且试样表面细胞活性大小的顺次为第三组>第二组>第一组。

1.3.2 杂交缓冲液 杂交缓冲液Ⅰ：溶解有10% 硫酸葡聚糖的 4×柠檬酸钠缓冲液，专用于miR-21 和阴性探针；杂交缓冲液Ⅱ：含 50% 去离子甲酰胺、10% 硫酸葡聚糖、80 mmol/L TE、0.6 mol/LNaCl 的 Denhardt 液，专用于 miR-34a探针。

比较图3中的增殖数据(吸光度)可以看出，培养168 h后，试样A和试样B之间的细胞活性有显著性差异，试样C和试样D之间的细胞活性也有显著性差异，这表明洗涤处理和预波纹化处理对涤纶经编小口径人工血管的细胞相容性的提升有显著影响，原因在于：

(1) 试样A培养24、96、168 h后吸光度没有差异(p>0.05)，这表明细胞在试样A表面不能很好地黏附和增殖。其中，培养24 h后较低的吸光度(低于培养24 h后空白对照组吸光度值的70%)表明，刚刚成形的管坯具有一定的细胞毒性。而经过洗涤处理后，人脐静脉内皮细胞在试样B表面的增殖有明显的提高，这表明洗涤处理可以除去织造过程中残留在管坯表面微小的污渍、油渍等杂质，以确保涤纶经编小口径人工血管无细胞毒性。

(2) 相比于试样C，细胞在试样D表面的增殖有了显著提高。尽管紧密化处理后试样C的线圈长度显著减小，但细胞增殖量没有显著提高；而预波纹化处理后试样D的线圈长度没有明显改变，但细胞增殖量却显著提高。这表明，预波纹化处理后的试样表面出现的波纹结构更适合内皮细胞的黏附及增殖。

图3 人脐静脉内皮细胞在试样表面培养24、96和168 h后的增殖情况(其中，*表示p<0.05，Δ表示p>0.05)

3.3 表面形貌

通过EVO LS 15扫描电镜观察涤纶经编小口径人工血管制备过程中表面结构的变化如图4所示，可以看出：

(1) 管坯成形阶段，试样A表面纤维排列平行度和取向度都较低，纱线蓬松，纤维间距离较大且表面含有杂质颗粒。

(2) 洗涤处理后，试样B表面杂质被清洗，纤维表面变光滑，同时纤维间距离减小且排列趋于整齐，但总体相较于试样A表面形貌没有发生明显的变化。

(4) 预波纹化处理后，试样D的线圈长度有少量的伸长(前梳3%，后梳6%)，但由于有波纹的存在，纤维之间受到挤压，纤维间距更加缩小、排列更加整齐。

(5) 波纹化处理后，试样E的表面结构已趋于平整，纤维排列整齐且取向度高，这有利于人脐静脉内皮细胞的取向黏附与增殖。

图4 涤纶经编小口径人工血管制备过程中的表面形貌

3.4 细胞黏附

通过EVO LS 15扫描电镜观察人脐静脉内皮细胞培养168 h后在试样表面的生长状态(图5)，可以看出：

(1) 试样A表面粗糙，纤维间距离较大(大于20 μm)，故很少有人脐静脉内皮细胞黏附于纤维之间，且黏附的人脐静脉内皮细胞是以单个的形式附着于单根纤维上的。同时，机油等可能存在的加工杂质会对人脐静脉内皮细胞的正常生理活动产生一定的影响，因此较难在试样表面寻找到黏附的细胞。

(2) 洗涤处理时，水流在超声波的震动作用下使纤维的排列由无序向有序过渡。所得试样B相对于试样A，纤维排列更整齐、间距更紧密，因此，细胞外基质可凭借其表面张力附着于纤维之间。但由于纤维间距仍然偏大，附着于相邻纤维上的人脐静脉内皮细胞之间无法建立相互联系，再加上试样结构蓬松、涤纶表面为疏水性，单个黏附于纤维上的细胞无法和纤维紧密结合，故很难在试样表面形成内皮层。

(3) 试样C经过紧密化处理，纱线交织点间的纤维排列已相对紧密，因此可看到有较多的人脐静脉内皮细胞黏附并将部分纤维覆盖，但由于纱线交织点旁的纤维仍然杂乱，因此依然不能使相邻的人脐静脉内皮细胞连成一片即不能很好地内皮化。试样C相比于试样B，试样C的生物相容性略有提高，但提高并不明显。

(4) 相比于试样C，预波纹化处理的试样D的表面有明显的人脐静脉内皮细胞的黏附，且相邻纤维上黏附的人脐静脉内皮细胞之间建立了联系，并开始沿纤维方向在纤维表面增殖，这是内皮化的开始。同时，在纱线交织点之间可以明显看到细胞外基质黏附于纤维之间，表明纱线交织点处纤维间间距与人脐静脉内皮细胞尺寸相当，这有利于人脐静脉内皮细胞横跨生长，并为快速内皮化提供了很好的结构保障。

(5) 相较于试样D，试样E在经过波纹化处理后表面更加平整，但内皮化进程并没有明显加快，这说明波纹化处理对于提高管状经编织物的生物相容性贡献并不大。

结合细胞增殖试验结果分析发现，在涤纶经编小口径人工血管的制备过程中，洗涤和预波纹化处理对细胞相容性有很大的提升。其中，洗涤处理消除了管坯表面因残留物所造成的细胞毒性，但不能消除表面结构对细胞黏附的影响，其对内皮化进程无推动作用。相比之下，预波纹化处理使得涤纶经编小口径人工血管的结构参数更加合理，表面更加平整，且纤维排列更加紧密，纤维平行顺直度和取向度明显提高。

本试验选取的人脐静脉内皮细胞的直径约为20 μm，单根涤纶的直径约为10 μm。波纹化处理后，涤纶经编小口径人工血管材料表面纤维平行排列且紧密，纱线交织处的高度小于人脐静脉内皮细胞的直径，因此聚集在交织处的人脐静脉内皮细胞可以沿垂直于纤维和平行于纤维的两个方向增殖爬行[图5(E)]，并使得黏附于交织处纤维表面的人脐静脉内皮细胞之间很容易地建立联系，促进人脐静脉内皮细胞的黏附及内皮化进程，从而在结构参数方面对提高涤纶经编小口径人工血管的细胞相容性做出贡献。

图5 人脐静脉内皮细胞在试样表面生长168 h后的黏附状态(试样A中绿色箭头所指及纤维上的白点为试样表面附着的杂质，试样B～试样E中绿色箭头所指为黏附在试样表面的人脐静脉内皮细胞)

4 结论

纵观涤纶经编小口径人工血管的制造过程发现，5道工序处理后试样表面的结构发生了明显的变化，这对试样的细胞相容性有着十分显著的影响，其中预波纹化处理对细胞黏附的影响最大。洗涤处理虽然可以除去试样表面的杂质，消除试样的细胞毒性，但不能改善试样的表面结构，促进细胞的黏附和增殖；但预波纹化处理可使试样表面的结构更加平整、纤维排列平行并紧贴、纱线交织点间距进一步缩小，这有利于相邻人脐静脉内皮细胞之间的相互联系，促进人脐静脉内皮细胞在试样表面的黏附与增殖，进而推动内皮化的进程。总之，依次经过管坯成型、洗涤处理、紧密化处理、预波纹化处理和波纹化处理后，涤纶经编小口径人工血管细胞相容性已经满足要求，且预计能在体外短时间内皮化，以适应体内病变部位的需求。