白及溶胶中植物蛋白的定性定量方法研究

车向前，陈 芳，常明泉*，陈 林

0 引言

白及溶胶是制备复方白及乳膏的前体原料，该溶胶是从兰科植物白及块茎中提取、脱色后制备而成[1]。复方白及乳膏具有软化角质、促进细胞生长、抗氧化、保湿润肤的功效[2-3]，用于治疗黄褐斑、干性皮炎、皮肤皲裂，也可用于鱼鳞病、银屑病的辅助治疗[4]。白及可用于上消化道止血、抗溃疡、肺结核、外用抗皲裂，也用于肿瘤的栓塞治疗[5]，目前，针对白及多糖的研究多集中于提取工艺、纯化工艺[6]，而对其中植物蛋白的研究仅局限于将其作为杂质去除。近年研究发现，一些植物蛋白除具有动物蛋白的作用外，还具有较好的药理活性，具有抗氧化、清除皮肤自由基的功能，该作用能抑制黄褐斑的生长，减退黄褐斑。复方白及乳膏能使黄褐斑减退并抑制其生长，可能与其含有一定量的植物蛋白有关[7]，为明确其药理作用和活性成分，更好地控制复方白及乳膏的质量，本文应用硝酸硝化显色法、色谱鉴别法对白及溶胶中的植物蛋白进行定性鉴别，应用考马斯亮蓝染色法对其中的植物蛋白进行定量检测。

1 仪器及试药

1.1 仪器 TU-1901型分光光度仪(北京普析通通用仪器有限责任公司)；BCD-610W型冰箱(博西华家用电器有限公司,功率：1.07 kW)；KM-410C型超声震荡仪(广州市科洁盟实验仪器有限公司，40 kHz)；WE-AS-10型实验室纯水机(深圳市宏森环保科技有限公司，功率：300 W)；XPE-分析天平(梅特勒-托利多公司，精度0.1 mg)；MH-1000型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司，300 W)；试管架(江苏新康医疗器械有限公司，13×50)；玻璃试管(20 ml、10 ml)。

1.2 试药 白及溶胶(太和医院自制，批号：20170322、20170410、20170416)；牛血清蛋白对照品(中检院，批号:160427-203942,25.0 mg/瓶)；考马斯亮蓝G-250(购自成都艾科达化学试剂有限公司，CBB，批号：6401-58-1)；乙醇(武汉市中天化工有限责任公司，批号:20161225，分析纯)；85%磷酸(武汉市中天化工有限责任公司，批号:20161212，分析纯)；85%浓硝酸(武汉市中天化工有限责任公司，批号:20160701，分析纯)；NaCl(沈阳试剂厂,批号:2016010599，含量95%～100.05%，基准试剂)；纯化水(太和医院新鲜)。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 硝化反应 阳性对照：取浓度为1 mg/ml的蛋白质对照品溶液2 ml于试管中，滴加浓硝酸2滴，静置2 min,观察颜色变化，结果呈黄色。供试品溶液：取白及溶胶0.1 g于试管中，加纯化水2 ml，超声分散溶解，滴加浓硝酸2滴，静置2 min,观察颜色变化，结果呈黄色，与对照品反应颜色一致。阴性对照：取纯化水2 ml于试管中，滴加浓硝酸2滴，静置2 min,观察颜色变化，结果澄清，无黄色呈现。

2.1.2 色谱鉴别 阳性对照：取浓度为10 mg/ml的蛋白质对照品溶液5 ml，加入双缩脲试剂5 ml，摇荡均匀，显紫色；供试品溶液:取白及溶胶10 g,加纯化水10 ml，超声溶解，过滤，收集滤液在水浴上蒸发至5 ml，加入双缩脲试剂5 ml，摇荡均匀，显紫色；阴性样品溶液:取纯化水5 ml，加入双缩脲试剂5 ml，摇荡均匀，溶液呈浅蓝色，无紫色出现。取上述3种染色液，以相应试剂为空白，在紫外分光光度仪上于400～700 nm波长处扫描，结果对照品溶液和供试品溶液在540 nm处均有最大吸收峰，阴性样品溶液在该波长处无最大吸收。

2.2 定量检测

2.2.1 溶液的制备 ①0.15 mol/L NaCl溶液的制备：精密称取0.438 7 g NaCl于50 ml容量瓶中，加纯化水溶解，定容,即得。②考马斯亮蓝染色液的制备:精密称取考马斯亮蓝50 mg溶于25 ml乙醇中，加入磷酸50 ml，混合，加纯化水稀释至500 ml，即得。③蛋白质对照品溶液的制备:精密称取牛血清蛋白对照品10 mg，置10 ml容量瓶中，加纯化水溶解，定容，即得1.0 mg/ml蛋白质对照品储备液，该溶液置冰箱中低温保存(4 ℃)，取该溶液0.2 ml于试管中，加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml，加入考马斯亮蓝G-250溶液10.0 ml，混匀，在室温放置5 min，使其反应充分，即得。④样品溶液的制备:取白及溶胶0.1 g于试管中，加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml,超声溶解，加入考马斯亮蓝G-250溶液10.0 ml，混匀，放置5 min,使其反应充分，即得。⑤空白样品溶液的制备:精密吸取0.15 mol/L NaCl溶液2 ml于试管中，加入考马斯亮蓝G-250溶液10.0 ml混匀，在室温放置5 min,使其反应充分，即得。

2.2.2 测定波长的选择 分别取“2.2.1”项下的蛋白质对照品溶液、样品溶液和空白样品溶液，在分光光度仪上于500～700 nm波长处扫描，记录扫描图，结果除空白样品溶液外，蛋白质对照品溶液、样品溶液在595 nm处都有最大吸收，设定595 nm为测定波长，扫描图见图1。

图1 紫外扫描图

2.2.3 曲线方程的建立 分别精密吸取“2.2.1”项下浓度为1.0 mg/ml的蛋白质对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml试管中，每管加0.15 mol/L的NaCl溶液至1.0 ml，混匀，分别取0.1 ml于对应编号的新试管中，分别加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 ml混匀，放置5 min,使其反应充分，即得每毫升含蛋白质对照品为3.92、7.84、11.76、15.69、19.61 μg的溶液,取各溶液分别在设定波长处测定吸收度，读数3次，取均值，用浓度值作为横坐标，用测得的吸收度值作为纵坐标，制定曲线方程：Y=0.036 X-0.000 5，r=0.999 5,蛋白质对照品在3.92～19.61 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 取“2.2.1”项下的蛋白质对照品溶液和空白样品溶液，在设定波长处连续测定吸光度5次，结果RSD为0.77%。

2.2.5 稳定性试验 取“2.2.1”项下经染色后的蛋白质对照品溶液，在设定波长处于0、1、3、6 h测定，记录吸光度值，结果RSD为1.89%，表明蛋白质对照品溶液在6 h内稳定。

2.2.6 重复性试验 平行精密称取白及溶胶0.1 g于试管中，共5份，按“2.2.1”项下样品溶液制备方法制备溶液，取“2.2.1”项下的空白样品溶液，在设定波长处测吸光度，计算每份样品的含量，结果RSD为1.34%。

2.2.7 回收率试验 精密称取已知含量的白及溶胶(批号：20170410)0.05 g，共9份，每3份为1组，分别按样品含量的80%、100%、120%加入蛋白质对照品溶液，按“2.2.1”项下样品溶液的方法制备，取该项下的空白样品溶液，在设定波长处测吸光度，计算各样品溶液的含量，回收率计算结果见表1。

表1 白及溶胶中植物蛋白回收率实验表(n=9)

2.2.8 含量测定 精密称取白及溶胶0.1 g(批号：20170322、20170410、20170416)于试管中，每个批号各3份，按“2.2.1”项下的方法制备样品溶液，取该项下的空白样品溶液，于设定波长处分别测定各份样品溶液的吸光度值，结果见表2。

表2 白及溶胶中植物蛋白含量测定结果(n=3)

3 讨论

植物蛋白中具有苯环的氨基酸结构，这类物质遇浓硝酸生成黄色化合物，既硝化现象[8]，利用该原理可以对白及溶胶中的植物蛋白进行定性鉴别。蛋白质分子中含有很多似双缩脲结构肽键，双缩脲试剂是一个蓝色的含铜碱性试剂，能与蛋白质中的肽键形成紫色的络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，双缩脲试剂染色后的含蛋白质溶液在紫外可见光谱为540 nm的波长处有最大吸收[9]，应用该原理可以对白及溶胶中的植物蛋白进行色谱鉴别。白及溶胶溶解液蒸发是为了缩小体积提高浓度，增加染色时的灵敏度。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质发生特异性结合后立即呈现蓝色。该溶液在紫外分光光度仪上在一定的波长范围内具有最大吸收,在相应浓度范围内，蛋白质与染色剂的结合量与测定波长的吸光度值成正比[10]，因而采用考马斯亮蓝染色法测定白及溶胶中的植物蛋白含量。

白及溶胶中不仅有多糖、植物蛋白，还有植物色素等物质，植物色素可能也产生一定的光密度值，因此，在配制样品时，应使蛋白质浓度在0.1 mg/ml以内，必要时适当增加考马斯亮蓝染色液的用量，以保证与蛋白质染色反应完全，减小其他成分对蛋白质测定可能产生的影响。酸碱对植物蛋白的测定会有一定影响，样品配制时加入0.15 mol/L NaCl溶液稀释，可缓冲其影响。在测定实验之前应把本实验所用器具用铬酸钾清洁液浸泡、用纯化水清洗干净，并避免使用石英吸收池，防止用具不洁对测定结果产生干扰，每次测定完毕用乙醇清洗比色皿，然后用纯化水清洗，以免考马斯亮蓝染色液在比色皿上存在残留。