全身振动训练对大鼠骨骼肌的改善及其作用机制研究

张轲 罗由平

宜宾市第二人民医院小儿外科，四川 宜宾 644000

更年期是妇女重要的身体过渡期，而绝经后骨质疏松症是一个严重的健康问题[1]。目前绝经后骨质疏松症的治疗在很大程度上依靠药物治疗[2]。然而，由于药物治疗过程带来的副作用导致部分患者依从性严重降低。相比之下，全身振动性训练法(Whole body vibration，WBV)作为一种自然、有效的非药物性手段，近年来在绝经后骨质疏松症治疗中越来越受到重视[3-4]。然而，WBV预防骨质疏松症的确切机制尚不完全清楚。

最近有报道，绝经后妇女[5]或去卵巢(ovariectomized，OVX)大鼠[6-7]的骨质疏松症与骨髓脂肪组织的增加导致以成骨细胞为代价的脂肪细胞的形成有关。成骨细胞和骨髓脂肪细胞来源于常见的骨多能间充质干细胞(BMSC)祖细胞[8]。据报道，机械负荷可以下调BMSCs中的过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARγ)，并以牺牲脂肪生成为代价促进成骨细胞生成[9]。已知β-连环蛋白是众所周知的多基因位点的调节脂肪细胞分化，包括PPAR衰减。机械应变通过持久的刺激β-连环蛋白信号来抑制间充质干细胞的脂肪形成[10]。此外，据报道机械负荷通过磷酸化骨骼肌细胞中GSK3β酶来抑制其活性，进而激活β-连环蛋白，进一步证明机械负荷可以利用GSK-3β/β -连环蛋白信号传导通路[11]。

因此，我们假设全身振动性训练法可能通过抑制OVX大鼠骨骼肌中GSK-3的表达来调节β-连环蛋白信号。在本研究中，我们考察了全身振动性训练法对OVX大鼠骨骼肌中PPARγ，β-连环蛋白和磷酸化糖原的表达合成酶激酶-3(P-GSK-3)蛋白质表达的影响，并与雌激素替代疗法的疗效进行比较。此外，我们还考察了全身振动性训练对血清黄体生成素(LH)和17β-雌二醇水平的影响，旨在为WBV改善绝经后骨质疏松症提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物和材料

健康3月龄雌性SD大鼠50只购自川北医学院动物实验中心(实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-0004)，体重(230 ± 25)g，所有大鼠分笼饲养在具有标准饲养条件的动物房。大鼠标准饲料由动物实验中心提供。哺乳动物细胞裂解试剂盒(MCL-1)、17β-雌二醇购自北京博欧实德生物技术有限公司，LH、E2试剂盒的试剂盒购于上海酶联生物科技公司。羊抗鼠β-连环蛋白单抗、兔抗鼠P-GSK-3β单抗、兔抗鼠PPARγ单抗、羊抗鼠β-actin单抗均购自上海广锐生物科技有限公司，二抗以及二氨基联苯胺(DAB)试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。LC-714扫频振动试验机购自上海林频仪器股份有限公司。BX51-P光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 动物分组和干预

所有雌性大鼠适应性饲养2周后，根据体重随机分为正常对照组、去卵巢组、17β-雌二醇治疗组和全身振动性训练组。正常对照组(Sham，n=10)大鼠进行与去势手术相同的手术操作，但仅切除双侧卵巢周围的小块脂肪组织；其余三组大鼠均实施去势手术。去势手术基本过程如下：大鼠经常规腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，仰卧固定，在无菌操作下以第13肋远端脊柱旁纵行切开，逐层分离，找到卵巢并完全摘除，最后逐层缝合。伤口用碘酒外擦，并于术后第2 d起每只大鼠肌注青霉素，连续3 d，3万U/d，以预防术后感染。术后适应性喂养7天，随机分为三组：去卵巢组(OVX组，n=10)，给予17β-雌二醇治疗组(E2组，n=10)和进行全身振动性训练组(WBV组，n=10)。术后14天，E2组大鼠皮下注射17β-雌二醇25 g/ kg，3次/周，共14周。术后7天，WBV组大鼠进行适应性振动训练，每天首先持续运动10 min、休息10 min后再连续运动10 min，振动频率50 Hz、振幅0.9 mm[12]。7天后，改用Tezval等[13]提出的方法进行振动训练，每天首先持续运动15 min、休息15 min后再连续运动15 min，振动频率90 Hz、振幅0.5 mm。大鼠在振动过程中允许在笼中自由移动。持续训练14周。每周根据体重变化调整E2的注射剂量。模型组和正常对照组均在同一时间灌胃摄入等质量蒸馏水，但不进行全身振动性训练运动。所有干预治疗均在早上进行。

1.3 组织收集

大鼠在最后一次运动或E2治疗24-36 h后处死，在处死前禁食12 h。从大鼠腹主动脉收集血液样品，4 ℃，1 800 g离心15 min，收集血清样本并冷冻保存。血液采集结束后立即分离并称重每只大鼠的子宫和内脏脂肪。然后将腰椎切除并清除软组织，将Wfth腰椎(L5)用生理盐水湿润的纱布包裹，并冷冻至-70 ℃以进行生物力学测量。剥离下肢取出双侧腓肠肌组织，一部分保存于在含4%甲醛的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中用于免疫组织化学，另一部分在液氮中冷冻以进行蛋白质提取。

1.4 血清E2和LH

通过放射免疫测定(RIA)测定血清E2(批内和批间变异系数：4.8%和10.0%)和LH(批内和批间变异系数：5.4%和10.2%)浓度。

1.5 生物力学测量

生物力学测量通过腰椎椎体与材料测试系统进行测定，在测试之前使用金刚石锯去除头侧和尾侧以便于加载至仪器表面。在测试过程中，每隔0.02秒收集一次力和位移测量值，从而得出极限力。

1.6 免疫组化

根据文献报道的方法进行免疫组织化学[14]。方法为：将腓肠肌组织进行脱蜡和水化，D用PBS冲洗后提取抗原，PBS洗涤3次，使用10%牛血清室温封闭1 h。然后在4 ℃下将切片与稀释的小鼠单克隆β-连环蛋白抗体(1∶100)孵育一个晚上，第二天用PBS洗涤组织，随后与生物素缀合的第二抗体(载体，1∶200)在37 ℃下温育1 h。PBS洗涤切片，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在37 ℃温育1 h。进行PBS冲洗，根据制造商的说明书用DAB试剂盒使第一抗体结合显现。最后用水洗涤组织，进行苏木精复染。为确保抗原特异性，使用动物免疫前IgG作为阴性对照进行平行实验。

1.7 蛋白质提取和Western blot分析

使用哺乳动物细胞裂解试剂盒获得腓肠肌组织的蛋白质裂解物。简而言之，在冰上，将50 mg腓肠肌组织置于RIPA缓冲液中进行匀浆，随后将匀浆物与该试剂盒一起提供的蛋白酶抑制剂混合物在冰上放置1 h，12000 ×g，4 ℃，离心30 min。收集上清液并测定蛋白浓度。制作10%～20% Tricine梯度凝胶，加入20 μg蛋白进行电泳分离，转移至纤维蛋白膜，并用5%脱脂牛奶溶液室温封闭1 h，加入1∶1000倍稀释的β-连环蛋白单抗(同免疫组织化学)、1∶1000倍稀释的P-GSK-3β单抗、1∶2000倍稀释的PPARγ单抗和1∶4000倍稀释的β-actin单抗与膜一起在4 ℃孵育过夜。膜洗3次，HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(1∶1000)室温孵育2 h。根据制造商的说明书进行NBT-BCIP检测。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 体重和脏器脂肪重量

在OVX术后第1周末，四组之间的体重没有显著差异。从OVX术后第2周到实验结束，OVX组的体重均显著高于Sham组(P<0.05)。从OVX术后第4周或第3周到实验结束，WBV组或E2组的体重均显著低于OVX组(P<0.05)，见图1A。

与体重变化相一致，OVX组的脏器脂肪重量显著高于Sham组(P<0.05)。在WBV或雌激素替代治疗的干预下，WBV组或E2组的脏器脂肪重量均显著低于OVX组(P<0.05)，见图1B。

图1 各组体重(A)和脏器脂肪重量(B)情况与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05Fig.1 Body weight (A) and organ fat weight (B) in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.2 血清E2和LH水平

OVX组大鼠血清LH比Sham组和E2组明显升高(P<0.05)，而WBV组血清相比较没有明显变化(图2A)。OVX组大鼠血清E2水平与Sham组、E2组和WBV组相比明显上升(P<0.05)(图2B)。

图2 各组血清LH(A)和E2(B)水平变化与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05Fig.2 The changes of serum LH (A) and E2 (B) levels in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.3 生物力学

如图3所示，与其他三组相比，OVX组的L5极限强度显著降低(P<0.05)。

图3 各组L5极限强度。与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05Fig.3 Ultimate Strength of L5 in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.4 Western blot分析结果

Western blot检测骨骼肌组织中PPARγ、β-连环蛋白和P-GSK-3β蛋白的表达，结果显示，与Sham组相比，OVX组骨骼肌PPARγ表达显著升高(P< 0.05)，而β-连环蛋白和P-GSK-3β蛋白表达均显著降低(P< 0.05)。在WBV或雌激素替代治疗的干预下，这一变化得到有效阻止，即WBV组或E2组的PPARγ较OVX组明显下降(P<0.05)，β-连环蛋白和P-GSK-3β蛋白表达均显著高于OVX组(P<0.05)，见图4。

图4 各组大鼠骨骼肌组织中PPARγ、β-连环蛋白和P-GSK-3β蛋白的表达情况与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05Fig.4 The expression of PPARγ, β-catenin and P-GSK-3β proteins in skeletal muscles of rats in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.5 免疫组织化学结果

免疫组织化学结果显示，Sham组的骨骼肌组织中β-连环蛋白阳性染色主要集中在细胞核和细胞质中。OVX组的细胞核和细胞质中几乎没发现β-连环蛋白阳性表达，而WBV组或E2组均存在β-连环蛋白阳性表达。在没有加入第一抗体的阴性对照中没有发现β-连环蛋白的免疫反应性染色。免疫组化观察到与Western blot结果相同的变化趋势，见图5。

图5 免疫组织化学方法检测骨骼肌中β-连环蛋白的表达(×100)A：Sham组，B：OVX组，C：WBV组，D：E2组，E：阴性对照组Fig.5 The protein expression of β-catenin in skeletal muscles detected by immunohistochemistry. Specimens were observed at magnification ×100. A: Sham group, B: OVX group, C: WBV group, D: E2 group, E: negative control group

3 讨论

WBV是一种新兴的训练方法，是指在被动的状态下通过振动来刺激肌肉反应和协调能力，进而提高肌肉伸缩力量[15-16]。近年来，WBV已经引起我国康复界和体育界研究人员的重视，如陆铁[17]等研究认为低量高频率全身振动干预是降低老年女性骨质疏松性骨折发生的有效措施；刘洋等[18]研究发现振动方案可延缓绝经后女性股骨上端骨丢失。然而，目前对WBV训练对骨骼肌的影响研究较少，尤其对于其作用机制的研究更是少见。因此，本研究的主要目的是强调WBV可以激活OVX大鼠骨骼肌中Wnt/β-连环蛋白信号传导通路，并抑制PPARγ蛋白的表达。研究结果显示，OVX大鼠腰椎强度显著降低，以及骨骼肌中β-连环蛋白和P-GSK-3β蛋白表达显著降低。所有这些OVX引起的变化都能通过WBV或雌激素替代治疗干预进行明显地逆转。此外，WBV干预不会产生雌激素对血清LH水平的影响。

骨密度是骨质疏松症诊断的良好预测指标，而骨强度是骨折风险的重要预测指标。本研究结果显示，OVX组的L5极限强度较Sham组显著降低，而这种降低可以被WBV干预治疗有效阻止。我们的结果与Bu等[19]报道的结果一致，因此可以认为WBV在防止绝经大鼠腰椎骨量减少有重要作用。

骨质量稳态受多种因素相互作用的调节，包括生长因子、全身性激素和机械负荷[20]。在这些因素中，机械负荷是骨细胞调整骨骼结构以维持骨强度的重要因素[21]。目前，已有研究发现Wnt/β-连环蛋白信号通路不仅在对骨机械负荷的正常生理反应发挥重要作用[22]，同时也是成骨细胞早期对负荷反应的一个组成部分[23]。由于β-连环蛋白的水平可以作为判断Wnt/β -连环蛋白信号传导通路激活的指标[24]，因此本研究首先分析了WBV干预后OVX大鼠骨骼肌β-连环蛋白的表达情况，Western blot分析和免疫组织化学结果发现WBV干预有效提高了骨骼肌中β-连环蛋白表达，表明Wnt/β-连环蛋白信号通路参与了运动抑制OVX大鼠骨质流失。最近的证据表明，机械应变通过持久刺激β-连环蛋白信号来抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化[25]，然而对于β-连环蛋白的机械刺激是否对OVX大鼠骨骼肌细胞向脂肪细胞分化产生抑制作用仍需进一步研究。

GSK-3β在经典Wnt信号通路中发挥关键作用，其通过对底物的磷酸化激活Wnt信号通路或使其失活，并参与骨量的调节。GSK-3β失活会导致β-连环蛋白稳定化并转移至卫星细胞的细胞核中，从而激活下游Wnt靶基因[26]。以往的研究表明，GSK3β可加快β-连环蛋白磷酸化进程，导致其被蛋白酶体降解。因此，细胞中β-连环蛋白水平的保存至少部分取决于机械负荷通过磷酸化GSK-3β酶来抑制其活性[25]。本研究中，WBV增加了OVX大鼠骨骼肌中GSK-3β的磷酸化，表明机械活化OVX大鼠骨骼肌中的β-连环蛋白信号可能部分取决于对GSK-3β活性的抑制作用。

PPARγ通过结合PPAR反应元件而对基因转录予以调节[27]。PPARγ和β-连环蛋白的功能相互作用已在包括BMSCs在内的一些组织和细胞中得到证实[28]。PPARγ表达降低可增加骨髓腔中成骨细胞生成，相反PPARγ表达增加可以通过诱导β-连环蛋白的降解来增强脂肪形成[29]。这些结果表明，防止β-连环蛋白的降解可以阻止干细胞向脂肪细胞分化。在本研究中，WBV不仅抑制了PPARγ蛋白表达，而且刺激了β-连环蛋白表达。提示WBV对降低脂肪量和防止骨量丢失的作用机制可能与调节骨髓间充质干细胞分化，并防止β-连环蛋白的降解有关，然而具体作用机制仍需进一步研究。

总之，我们的数据表明WBV能有效预防OVX大鼠的骨质流失，并提高骨质强度，这可能与抑制OVX大鼠骨骼肌中GSK-3β和PPARγ活性来激活β-连环蛋白信号传导通路有关。此外，WBV与雌激素替代治疗干预治疗疗效相当，但是WBV干预不会产生雌激素对血清LH水平的影响。