骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠下颌骨显微结构及最大载荷的影响

曾辉 赵许兵 徐红艳 左艳萍 周芳

1. 西安医学院口腔医学系，陕西 西安 710021 2. 西安交通大学口腔医学院急特诊科，陕西 西安 710004 3. 陕西省人民医院，陕西 西安 710068

骨质疏松是影响超过20%50岁以上女性的一种普遍病理状况[1]。骨质疏松症的主要特征包括骨矿密度降低、骨显微结构破坏，以致骨的脆性增加，骨折危险性增高[2]。研究显示，绝经后妇女的骨质疏松症可明显累及下颌骨，颌骨骨质丧失是骨质疏松在口腔颌面部的局部表现[3]。颌骨骨质疏松可加重牙周炎骨吸收，使牙齿缺失率增加[4]，同时，颌骨密度降低也影响牙种植体早期骨整合[5]，是影响牙种植体成功的危险因素之一。目前，对全身骨质疏松有改善作用的药物对颌骨结构、骨量等的作用如何，已成为研究热点[6]。骨碎补总黄酮是从中药骨碎补中提取出来的最主要的一种黄酮成分。研究表明，骨碎补总黄酮可增加骨质疏松大鼠股骨和腰椎的骨密度，改善骨显微结构[7]，并已初步运用于临床骨质疏松症的辅助治疗[8]。本项研究拟将骨碎补总黄酮以全身用药的方式给予去势雌性大鼠，从下颌骨骨量(骨密度)、下颌骨微结构和最大载荷三个方面探讨骨碎补总黄酮对颌骨骨质疏松的改善作用，以期为骨碎补总黄酮防治颌骨骨丢失的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

40只3月龄雌性未孕SD大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体重(230±30)g。自由饮水，分笼饲养。适应性饲养一周后，按体重对等原则随机分为5组：假手术组(Sham)、去卵巢模型组(OVX)、戊酸雌二醇组(EV)、骨碎补总黄酮低剂量组(GB-L)和骨碎补总黄酮高剂量组(GB-H)，每组8只，实验过程中无动物死亡。

1.2 实验药物与试剂

骨碎补总黄酮(中国中医研究院西苑医院和四川中药研究所研制，批号961214)，使用时加灭菌水制成一定浓度溶液(0.46 g/L)灌胃治疗。戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司，批号20130009)。水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。显微CT仪(Inveon, Siemens, Germany)，日本岛津自动控制万能试验机(AG-IC型号)，超纯水仪(Milipore，France)。

1.3 大鼠下颌骨骨质疏松模型造模与给药

Sham组仅切除双侧卵巢附近脂肪组织，其余各组行双侧卵巢切除术。10%水合氯醛按0.38 mL/100 g体重，腹腔注射，对大鼠进行麻醉。将大鼠固定于手术台上，在背部1/3处剪毛，用碘酊、酒精局部消毒皮肤，取腰椎后侧正中切口，钝性分离肌肉组织，可见位于两侧肾脏外下方呈淡粉红色的卵巢及子宫，在子宫角上作两个结扎后切断子宫角，将卵巢完整摘除后撒上青霉素粉，缝合皮肤，消毒伤口。术后一周对建模大鼠进行阴道涂片，连续5 d，观察去卵巢大鼠不出现动情周期，表明去除卵巢成功。术后3个月，各组大鼠进行灌胃治疗。

GB-H组灌胃给予骨碎补总黄酮216 mg/(kg·d)，GB-L组灌胃给予骨碎补总黄酮108 mg/(kg·d)，EV组灌胃给予戊酸雌二醇0.1 mg/(kg·d)，Sham组和OVX组给予等计量的生理盐水，连续服药12 w。

1.4 下颌骨骨密度测量

各组大鼠灌胃治疗12 w后过量麻醉处死，取大鼠左侧下颌骨并剥离附着在上面的软组织，冻存于-80 ℃冰箱中备用，测量前于室温下解冻。将大鼠下颌骨置于Micro-CT扫描球管中进行正位扫描，采用手动分析模式测定下颌骨骨密度。骨密度以骨量/骨投影面积(g/cm2)表示。

1.5 下颌骨Micro-CT定量参数测量

将处理好的下颌骨标本沿长轴垂直固定于样品固定器内，选择扫描参数：扫描方式360°旋转，电压80kV，电流80μA。图像矩阵为1024×1024，曝光时间2 960 ms。扫描完成后，如图1所示，选取第二磨牙近中根的近中至第三磨牙远中根的远中根尖1/3区的骨组织为感兴趣区域(region of interest, ROI)行三维重组。获得重组图像后，使用Mirco-CT自带软件进行定量分析。各测量分析参数及意义见表1。

1.6 下颌骨最大载荷测量

各组大鼠灌胃治疗12 w后过量麻醉处死，将右侧下颌骨关节端及切牙端包埋于树脂当中，下颌磨牙区暴露，树脂块底部与地平面平行，置于日本岛津自动控制万能试验机测试，加载点为下颌第二磨牙处，跨距为20 mm，加载速度为0.5 N/min，逐渐加力，直至骨完全断裂，实验中用生理盐水喷洒下颌骨表面，保持湿润。

注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠下颌骨骨密度测量结果

各组大鼠下颌骨骨密度测量结果见表2。由表2可以看出，OVX组与Sham组相比，下颌骨密度显著降低(P<0.05)。EV组干预治疗12 w后，已有明显的修复作用，与Sham组相比无统计学意义(P>0.05)；GB-H组干预治疗12 w后，下颌骨骨密度虽未恢复至正常水平，但骨密度已比OVX组显著提高(P<0.05)；GH-L组下颌骨骨密度虽有一定程度增加，但与OVX组相比尚无统计学意义(P>0.05)。

组别样本量骨密度Sham81.118±0.006# OVX80.797±0.041∗ EV81.108±0.013# GB-L80.909±0.027∗ GB-H81.013±0.033∗#

注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05

2.2 各组大鼠下颌骨Micro-CT三维测量结果

图1 各组大鼠下颌骨显微结构图，红色区域为显微CT目标分析区域A:假手术组；B:去卵巢模型组；C：戊酸雌二醇组；D：骨碎补总黄酮低剂量组；E：骨碎补总黄酮高剂量组Fig.1 Micrographs of the vertical section of mandible in rats of different groups. The red area is the micro-CT target analysis area. A: Sham group; B: OVX group; C: EV group; D: GB-L group; E: GB-H group.

各组大鼠下颌骨骨组织的感兴趣区行三维重组后得出三维测量结果(表3，图1)。由表3可知，OVX组与Sham组相比，下颌骨BV/TV下降56.6%，Tb.Th、Tb.N显著降低(P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp则明显增加(P<0.05)，骨微结构出现异常。与OVX组比较，EV组大鼠下颌骨BV/TV显著上升(P<0.05)，Tb.Th、Tb.N显著增加(P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp显著减小(P<0.05)，骨微结构得到良好修复，已与Sham组无明显差异(P>0.05)。与OVX比较，GB-H组的BV/TV上升41.6%，Tb.N增加42.2%，BS/BV、Tb.Sp显著减小(P<0.05)，Tb.Th尚未显示出统计学差异，以上结果显示高剂量的骨碎补总黄酮对下颌骨微结构有一定程度的改善作用。与OVX组比较，GB-L组BV/TV上升20%，Tb.N增加24%，Tb.Sp显著减小(P<0.05), Tb.Th、BS/BV无明显改变(P>0.05)，实验结果显示低剂量的骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠下颌骨微结构有一定改善趋势，但效果不及高剂量组。

2.3 各组大鼠下颌骨最大载荷测量

如表4所示，与Sham组比较，OVX组大鼠下颌骨的最大载荷明显下降(P<0.05)；EV组与OVX组比较，可显著提高去卵巢大鼠下颌骨最大载荷(P<0.05)，与Sham组相比无统计学差异(P>0.05)；GB-L组的下颌骨最大载荷较OVX组有所提高，但差异无统计学意义(P>0.05)；GB-H组可明显提高去卵巢大鼠下颌骨的载荷水平(P<0.05)。实验结果提示高剂量的骨碎补总黄酮可改善下颌骨的最大载荷水平。

组别样本量最大载荷Sham8163.77±15.82# OVX893.87±18.65∗ EV8153.89±19.23# GB-L8119.83±15.67∗ GB-H8132.98±16.73∗#

注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05

3 讨论

1960年Groen[9]首次报道，颌骨骨丢失与骨质疏松症有相关性。近年来，不少学者对全身性骨质疏松与颌骨骨质疏松等口腔骨丢失间的关系做了若干研究，大多研究结果证实颌骨骨丢失是全身骨质变化的局部表现[10]。Sindeaux等[11]研究证实，全身性骨质疏松患者口腔骨密度下降概率显著增加，López等[12]研究表明，骨质疏松女性患者同正常女性一样，下颌骨骨密度和躯干骨密度呈高度一致性。Jonasson[13]通过5年追踪研究证实，下颌骨骨量丧失与骨密度显著相关。另有研究发现，骨质疏松女性患者的全身骨量、下颌骨骨量和下颌余牙数目有显著相关性，骨质疏松患者的牙齿缺失率明显高于正常组[14]。在诸多骨质疏松动物模型中，切除成年雌性大鼠双侧卵巢的方法被广大研究者认识和接受[15]，也逐渐用于颌骨骨丢失的研究中。研究证实，去势大鼠雌激素水平下降可致使下颌骨骨矿密度降低、骨微结构破坏[16]，因此，将去卵巢模型用于诱发下颌骨骨丢失是一个可靠模型[17]。在本实验中，Micro-CT结果显示OVX组大鼠下颌骨密度较Sham组显著下降(P<0.05)，骨体积分数明显降低(P<0.05)，反映了去卵巢大鼠下颌骨骨组织体积含量明显下降，下颌骨松质骨结构呈疏松化改变。此外，OVX组的骨小梁数目、厚度以及骨表面积体积比较Sham组明显降低(P<0.05)，而骨小梁间隙明显升高(P<0.05)，说明模型大鼠下颌骨骨小梁大量丢失、间隙增宽、骨结构退变，再次说明去卵巢大鼠下颌骨出现了骨质疏松样症状。同时，OVX组大鼠的下颌骨最大载荷较Sham组明显减小(P<0.05)，提示伴随着下颌骨骨量减小、骨微结构改变，去卵巢大鼠的下颌骨抗外力冲击能力也显著下降。故在本实验条件下，用去卵巢手术制成大鼠下颌骨骨质疏松的动物模型是成功的。

本次实验结果显示，与OVX组相比，戊酸雌二醇组的下颌骨骨密度显著增加(P<0.05)，骨体积分数、骨小梁数目及厚度也明显增加(P<0.05)，骨小梁间隙显著减小(P<0.05),戊酸雌二醇对去卵巢大鼠下颌骨骨质疏松模型有良好的修复作用，可以明显改善下颌骨微结构，增加下颌骨骨量；力学实验证实戊酸雌二醇对下颌骨骨质疏松大鼠的力学性能也有明显的修复作用。目前，雌激素替代疗法对下颌骨骨质疏松的治疗已进入临床研究当中，并已取得一定成果[18]。但大量研究证实，雌激素替代疗法虽可降低骨转换、保持骨量，但该治疗方案会显著增加子宫内膜增生和乳房痛的患病风险[19,20]，甚至导致乳房癌[21]和子宫内膜癌。

骨碎补总黄酮是骨碎补中所含黄酮类化合物的总和，性苦、温，入肝、肾经。具有补肾壮骨、续伤止痛的功效。体外实验证实，骨碎补总黄酮能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[22]，并能提高成骨细胞的活性和增殖速度，增加骨形成[23]；动物实验研究显示，骨碎补总黄酮能改善股骨超微结构[24]，提高去势大鼠胫骨骨密度，提高骨质量[25]；临床研究进一步证实骨碎补总黄酮可减轻骨质疏松患者的骨痛症，升高股骨、腰椎的骨密度[26]。由于口腔骨丢失是全身骨质变化的局部表现，因此，应用骨碎补总黄酮对颌骨骨丢失进行防治研究具有合理性。

本研究显示，骨碎补总黄酮连续治疗12 w后，各治疗组下颌骨骨密度均有提高，其中骨碎补总黄酮低剂量组与OVX组相比较无统计学差异(P>0.05)，骨碎补总黄酮高剂量组较OVX组下颌骨骨密度显著增加(P<0.05)，但未修复至正常水平，与Sham组相比仍有统计学差异(P<0.05)。三维重建结果显示，骨碎补总黄酮低剂量组的下颌骨相对骨体积、骨小梁数目较OVX组显著上升，骨小梁间隙较OVX组显著下降，各项指标与Sham组相比均有统计学差异(P<0.05)；骨碎补总黄酮高剂量组的治疗效果优于低剂量组，骨体积分数、骨小梁数目较OVX组显著上升(P<0.05)，骨表面积体积比、骨小梁间隙较OVX组显著下降(P<0.05)，其中骨体积分数、骨小梁数目与Sham相比已无统计学差异(P>0.05)。最大载荷测量结果显示，各治疗组均能提高下颌骨最大载荷，低剂量组与OVX组相比尚无统计学差异，高剂量组虽未恢复至正常水平，但最大载荷较OVX组显著增加(P<0.05)。以上结果说明骨碎补总黄酮能增加去卵巢大鼠下颌骨骨量且连续性较好，改善下颌骨微结构，恢复下颌骨最大载荷，对下颌骨骨量丢失有一定保护作用。而本实验中是否高剂量骨碎补总黄酮仍未达到最佳治疗效果，可在后期进一步研究探索。

综上所述，去卵巢可诱导大鼠下颌骨骨丢失，出现骨质疏松样改变。骨碎补总黄酮可以提高去卵巢大鼠下颌骨骨密度及最大载荷，改善下颌骨微结构，高剂量组优于低剂量组。但此防治作用的具体机制、最佳剂量等有待进一步研究和探讨。