缓激肽B2受体基因多态性+9/-9bp对骨关节炎患者血清NO产物水平的影响

施犇 陈烁 赵建宁

第二军医大学南京临床医学院 南京总医院骨科，江苏 南京 210002

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)泛指发生在人体关节及其周围组织的无菌性炎性疾病，OA的主要特点是关节软骨的变性、破坏、骨赘形成及关节间隙变窄等，这些将导致关节疼痛、畸形和患者的功能障碍，其发病率高，致残率高，将是影响人们生活质量和健康的关键性问题[1,2]，OA的病因学尚不明确，研究表明年龄、创伤、自身免疫反应和力学因素都与OA的发生和发展有关[3,4]。除了经典的诱发因素，研究已经表明，基因多态性可能与OA的发病机制有关[5-7]。由于诊断方法有限，目前的治疗OA主要是控制炎症同时缓解患者痛苦。据报道缓激肽B2受体(Bradykinin B2 receptor，BDKRB2)拮抗剂的应用，对患有膝关节OA患者产生持久的镇痛效果，这意味着OA进展中缓激肽有潜在的关键作用[8,9]。

缓激肽(Bradykinin，BK)是由激肽释放酶作用于激肽原而产生的寡肽酶，对大部分的炎症反应包括充血、蛋白渗出和疼痛都有作用[10,11]。这些BK有助于炎症的启动和维持，进而导致疼痛，高代谢状态，随后软骨细胞凋亡，关节软骨变性。这些反应大多数是由BDKRB2介导的[12]。BDKRB2广泛分散在身体的大部分组织中从而介导大多数的炎症事件，包括通常受到OA影响的关节组织[13]，BDKRB2被认为是一个强大的血管舒张和炎症介质，它是通过增加产生和释放一氧化氮(Nitric Oxide，NO)产物来实现。有研究表明在风湿性疾病里一些类风湿关节炎和OA患者的血清和关节液样本中亚硝酸盐浓度的增加[14]。

BDKRB2的转录被其受体的基因多态性影响，一些研究报道，BDKRB2基因多态性+9/-9 bp与受体的转录活性有关[15,16]。另有研究表明BDKRB2受体基因多态性与一系列的病理的改变有关联包括糖尿病[17]，肺动脉压力[18]和左心室量增加导致的高血压[19]。我们以前研究最初揭示BDKRB2多态性(+9/-9 bp和-58 t / C)和OA的易感性以及严重性之间的关系[20]。尽管我们已经了解到BDKRB2在炎症中作用以及其基因多态性与OA的关系，但是BDKRB2基因多态性在滑膜炎症的作用机制仍尚不清楚。已经知道BDKRB2与OA的关系，还有与NO产物的关系，以及NO产物和炎症之间的联系，现在我们试图探索在OA可能参与炎症反应中BDKRB2的基因多态性和NO产物之间的关系。

1 材料和方法

1.1 对象

从2015年6月到2016年11月156例我院收治的膝关节OA患者和58健康志愿者参加了这次研究。这项研究是南京总医院伦理审查委员会批准，研究的所有参与者都签署了书面知情同意。诊断膝关节OA的标准是基于美国大学风湿病学标准以及用凯尔格伦-劳伦斯(Kellgren-Lawrence，KL)分级评估OA的严重性。患者诊断为其他类型的膝关节疾病而不是患有OA则被排除。对照组为没有关节炎病史或相关症状如关节疼痛、肿胀、压痛或活动受限。记录实验对象所有的危险因素包括性别、年龄、膝关节活动、身体质量指数(Body Mass Index，BMI)、吸烟状况和运动情况。BMI>30 kg/M2被定义为肥胖。

1.2 BDKRB2基因分型

DNA从外围血液样本中提取，使用DNA分离试剂盒 (Qiagen，Valencia，CA，USA)。BDKRB2基因多态位点(+ 9/-9，rs5810761)的检测根据前用方法[21]。等位基因和基因型频率在OA患者和对照组之间比较使用卡方分布检验或者Fisher精确检验(n<5)，P<0.05有统计学意义。

1.3 实时定量PCR

滑膜组织标本来自156 例关节置换手术OA患者。由于伦理问题健康组没有获得滑膜。比较不同的基因型BDKRB2在OA患者中的表达水平，RNA从滑膜组织提取并使用第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen，Grand Island NY，USA)合成cDNA。基因表达是由定量实时PCR使用Prime Time Mini qPCR Assays (Integrated DNA Technologies，Iowa，USA)。PCR反应用ABI 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)显示。BDKRB2基因定量表达通过与管家基因HPRT1、GAPDH和18 s的平均表达水平的比较获得。每个cDNA样本，都有3管样品进行测量(18 s(n=3)，GAPDH(n=3)，HPRT1(n=3)，和BDKRB2(n=3))。三个管家基因平均Ct值(3x3)被用来和BDKRB2对照比较。相对的BDKRB2及其变异型的表达水平通过使用2-ΔCt方法与管家基因水平进行分析。Kruskal-Wallis tests进行检验BDKRB2+9/-9 bp多态性相对于对照的表达是否存在统计学差异。所有的引物和探针序列表1中可见。

1.4 NO产物的测定

收集血液样本通过EDTA离心管的获得血清，在4 ℃下2500转离心10分钟，然后在-70 ℃保存，直到分析。NO产物通过间接使用NO试剂盒(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)测量NO衍生物硝酸盐和亚硝酸盐的量获得。取血清样本(50 μL)被添加到96孔板，通过Griess试剂显色，吸光度通过照度计读板确定在540 nm。

表1 BDKRB2定量PCR中各基因引物序列和探针Table 1 The primers for quantitative PCR analysis of BDKRB2.

2 数据分析

所有数据使用SPSS软件分析(SPSSv21)。相关数据分析使用Pearson相关检验。多元回归分析是为了验证发现的相关性和重要性。统计学意义是评估使用双侧Mann-Whitney-U检验，Kruskal-Wallis检验和t检验分别检验非参数和正态分布数据，P<0.05具有统计学意义。

3 结果

实验对象OA患者的BMI明显高于对照组(P=0.001)，但在其他人口学和临床特征方面，如性别、年龄、吸烟状态、体力劳动、家族史情况等，并无明显差异(表2)。

表2 研究对象的人口学及临床特点Table 2 Demographic and clinical characteristics of all subjects in the study.

注：ns：无显著差异；*：有显著差异。

Note，ns: not significant.*：Statistically significant.

为研究缓激肽B2受体基因多态性+9/-9与骨关节炎患者血清NO产物的关系，血清NO衍生物硝酸盐和亚硝酸盐被检测。结果显示与+9/+9 bp基因型组相比，+9/-9 bp和-9/-9 bp患者血清NO水平更高(图1 A)。相关性分析显示BDKRB2 mRNA与NO水平呈显著正相关(图1B，Pearson相关系数=0.458，P<0.001)。血清NO产物水平与骨关节炎放射学分型之间的关系分析结果显示与健康对照者相比，骨关节炎患者血清NO水平显著升高，且随着KL评分增加而增加(图2)。

图1 BDKRB2基因多态性+9/-9 bp对OA患者血清NO产物水平的影响Fig.1 Effect of the BDKRB2 +9/-9 bp polymorphism on NO production in serum samples of OA patients.

图2 血清NO产物水平与OA严重程度的关系Fig.2 Correlation between serum NO production levels and the severity of OA.

逐步多元线性回归(MLR)分析血清NO水平相关的预测因子，确定了几个重要的独立预测因子：BDKRB2多态性、肥胖、KL分级、性别和年龄，用于随后的MLR分析。因变量OA血清NO水平MLR分析表明，BDKRB2多态性、肥胖和OA评分与血清NO水平呈独立相关性(表3)。在所有OA患者中，血清NO水平与BDKRB2多态性、肥胖和OA评分的相关系数分别为0.806(P<0.001)、-0.188(P=0.009)、0.772(P<0.001)。经性别和年龄两因素校正后，MLR分析表明血清NO水平与BDKRB2多态性和KL评分均呈正相关(β=0.804；95% CI， 8.37 to 10.60和β=0.259；95% CI，0.74 to 4.45)，与肥胖呈负相关(β=-0.132；95% CI，3.75 to -0.65)。

表3 逐步多元线性回归(MLR)分析OA患者血清NO水平相关的预测因子Table 3 Multiple linear regression of the dependent variable serum NO level in OA patients.

注：复相关系数=0.682，校正决定系数=0.676

Note，Multiple R2=0.682, Adjusted R2=0.676

4 讨论

OA是一种引起疼痛并导致关节功能逐渐丧失的退行性关节疾病，如不及时加以治疗，最终令患者致残并严重影响其生活质量[22]。该病不仅发生关节软骨损害，还累及整个关节，包括软骨下骨[23]、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终发生关节软骨退变、纤维化、破裂、溃疡及整个关节面的损害。骨关节炎的病因尚不明确，研究表明年龄、创伤、激素和机械因素都与骨关节炎的发生和发展有关[24,25]。

近年来，大量研究已经揭示BK在各种生理反应中的重要作用，例如：炎症反应，血管通透性的改变，低血压，水肿[26]，平滑肌的收缩以及体内糖的平衡[27]，现已知缓激肽绝大多生理作用是由BDKRB2介导的[28]，在这项研究中我们继续探讨了BDKRB2基因多态性在OA患者的滑膜中的基因表达和NO产物水平的作用。我们的结果显示，BDKRB2基因多态性+9/-9 bp与受体基因的表达和NO产物水平具有相关性。

NO被认为是导致骨关节炎发生发展的重要因素，其作用包括协调表达促炎细胞因子、诱导软骨细胞凋亡以及抑制胶原蛋白和蛋白聚糖的合成。以前的研究当中已经证实在类风湿关节炎以及骨关节炎NO产物水平是增高的[14,29,30]。在我们的研究当中，NO产物水平在OA患者中相比正常人的水平要高，同时也和其OA患者疾病严重程度相关。尽管较高NO产物是促进炎症的重要因素，但是NO在炎症中如何作用仍不明确。近来研究提示NO及其氧化还原产物可能对软骨细胞具有保护作用[31]，进一步研究可能有助于阐述NO在OA进程中的潜在作用。

在OA患者的滑膜中BK是一种具有舒张血管及促成炎症的直链9肽，它通过刺激内皮细胞释放NO来产生舒张血管的作用。BDKRB2受体广泛存在于包括关节组织在内的各种组织中，骨关节炎患者的血管内皮细胞、成纤维细胞和滑膜衬里细胞都检测出BDKRB2[32]。它通过引发并维持炎症反应，刺激神经纤维并提高神经纤维敏感性，从而导致疼痛，激活滑液和软骨中内环境平衡的主要细胞：滑膜细胞和软骨细胞另外还能协同增强促炎因子产生的作用，持续表达于多数组织，通过持续产生和释放一氧化氮产生强烈的扩张血管和致炎效果[33]。我们发现在OA患者滑膜组织中BDKRB2的水平和血清中NO产物水平是正相关的，然而其中的机制仍不清楚，有可能和NO通路的诱导途径有关。

人类的BDKRB2基因位于染色体14q32[34]，基因含有数个多态位点，在基因的第1个外显子有9个碱基对的插入点/缺失点(+9/-9，rs5810761)，启动子区有C-T转换点(C -58T，rs1799722)[35]。既往研究已经表明BDKRB2+9/-9 bp多态性与基因的转录有关[15,16]。在这次研究当中我们试图去检验BDKRB2 +9/-9 bp基因多态性对骨关节炎的患者的NO产物是否有影响，结果显示在OA患者中与+9/+9 bp基因型组相比，+9/-9 bp和-9/-9 bp患者血清NO水平更高。多元线性回归(MLR)分析血清NO产物水平与BDKRB2基因多态性和关节炎严重程度成正相关。我们的数据可能提示在OA的患者中-9 bp等位基因的携带者可能BDKRB2更多的转录从而导致缓激肽的作用产生更多的NO产物从而影响OA的发生发展。

此次研究还具有一定的局限性，首先一定比例的肥胖患者纳入此次研究，尤其有1例BMI值相当高的病例出现在我们研究的OA患者当中，这可能误认为在OA的发生发展中肥胖不仅是作为一个机械的重要因素，也可能作为从细胞水平影响的重要因素，另外在纳入患者中可能存在一定的偏移。其次尽管BDKRB2的表达与NO产物的有相关性，然而BDKRB2多态性与OA的严重程度的机制还需进一步分析揭示。

我们的研究结果表明BDKRB2基因多态性+9/-9 bp可能影响着基因的表达和NO产物的水平，同时NO产物水平也和OA严重程度正相关。BDKRB2基因多态性与OA易感性和严重程度得到进一步验证。BDKRB2基因多态性在OA的发生发展中起着重要的作用，可能作为一类重要的基因调节机制。