藤黄健骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度和骨代谢的影响

颜春鲁 李盛华 郭爱军 安方玉 刘永琦 宋敏 陈丽 王鹏 马正民 牛彦强

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2. 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000 3. 兰州理工大学，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的慢性代谢性骨病，起病比较隐匿[1]。寻找骨质疏松的防治方法成为医学者关注的焦点。根据中医学“肾主骨生髓”的理论，参照藤黄健骨胶囊的方剂组成(熟地黄、鹿衔草、骨碎补、肉苁蓉、淫角藿、鸡血藤、莱菔子)，我们推测藤黄健骨胶囊的补肾强骨活血作用有可能影响骨质疏松模型大鼠的骨代谢。鉴于此，我们采用去卵巢法建立骨质疏松大鼠模型，通过观察其骨代谢生化指标，骨质微结构及骨密度等指标的变化，揭示藤黄健骨胶囊防治骨质疏松的作用机制，为藤黄健骨胶囊的临床应用和后续开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

60只SPF级SD雌性大鼠，体重(180±20)g，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2主要试剂

水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20150105)； Rat trACP ELISA Kit检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：E20151102B)；Rat BGP ELISA Kit检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：E20151201A)。

1.1.3主要仪器

iMark型自动酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)；FA2004 N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ZY12306型微量加样器(ScienTiFic产品)；T6新悦-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)；双能X骨密度仪(GE公司，美国)；AG-IX生物力学万能实验机(岛津公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1实验药物及给药剂量

藤黄健骨胶囊(甘肃省西峰制药有限责任公司，国药准字Z20123001，批号：503010)，人的临床用量为：2 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法：2 g×0.018×5≈0.18 g/kg，作为中剂量。则藤黄健骨胶囊高、中、低剂量分别为0.36、0.18、0.09 g/kg；西药对照组药物为戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20130009，批号：156 A)；青霉素(华北制药股份有限公司，国药准字：H13020657，批号：F6042103)。

1.2.2动物分组、造模及给药

参照文献[2]，4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉动物体重，俯卧位，备皮，消毒手术区皮肤。沿背部后正中线作一1.0-1.5 cm的纵形切口乳白色发亮的脂肪团中找到棕黄色的卵巢，沿子宫角处结扎并切除卵巢，逐层缝合伤口。假手术组大鼠只切除卵巢周围脂肪，其含量与卵巢重量一致。术后给予青霉素抗感染，大鼠术后注意保温。造模成功12 w后，将SPF级SD雌性大鼠随机分为5组，分别为假手术组、模型组、西药对照组(戊酸雌二醇片组)、藤黄健骨胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只，另设假手术组10只。给予药物干预，西药对照组给予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 mg/kg)灌胃治疗，藤黄健骨胶囊药物干预组按高、中、低剂量(0.36、0.18、0.09 g/kg)灌胃治疗，假手术组和模型组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，连续4周[3,4]。

1.2.3指标测定

(1)动物一般状况观察：观察并记录各组大鼠体重，精神状态，毛发，活动，饮食饮水，大小便等。

(2)骨代谢相关血清生化指标测定：末次给药后，腹主动脉采血，静置2-3 h，1500 rpm/min，离心10 min，分离血清。检测各组动物血清骨钙素(osteocalcin，BGP)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)等指标。具体操作按试剂盒说明书进行。

(3)骨密度的测定：末次给药结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉各组动物，四肢展开平置于双能X 线吸收测量仪平台上，通过计算机系统中小动物软件测定右股骨部位骨密度(bone mineral density，BMD)。

(4)骨生物力学检测：处死大鼠后取出完整股骨，将其右侧股骨送至陆军总院，用AG-IX生物力学万能实验机检测最大载荷和断裂载荷等相应指标。

(5)HE染色观察骨形态学变化：动物处死后取完整股骨，对左侧股骨脱钙处理并脱蜡至水，蒸馏水2-5 min，苏木精30 min，1%盐酸乙醇20sec，自来水冲洗。1%伊红复染后蒸馏水冲洗30sec。脱水、封片、镜检。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 一般状态及体重结果

与假手术组比较，模型组及各干预组大鼠皮毛欠光滑，其他一般状况(精神状态、活动、饮食饮水、大小便)均未见明显异常。与模型组对比，西药对照组及藤黄健骨胶囊各干预组精神状态、活动、饮食饮水、大小便均无差异。与假手术组比较，模型组及给药组大鼠体重均明显升高(P<0. 05)；与模型组比较，藤黄健骨胶囊高剂量组体重显著降低(P<0. 05)；藤黄健骨胶囊低、中剂量组和西药对照组体重较模型组降低，但无显著差异。见表1。

表1 藤黄健骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠末次给药后体重的影响Table 1 Effect of gamboge strong-bone capsule on the weight of ovariectomized rats after the last drug given

注：与假手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.2 对骨代谢相关血清生化指标的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清BGP含量显著降低，trACP含量显著升高(P<0. 05)；与模型组比较，藤黄健骨胶囊各干预组和西药对照组血清BGP含量含量均显著升高，藤黄健骨胶囊高剂量组血清trACP含量明显降低(P<0. 05)。见表 2。

表2 藤黄健骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠血清生化指标的影响Table 2 Effect of gamboge strong-bone capsule on the serum biochemical indices in ovariectomized rats

注：与假手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.3 对骨密度的影响

与假手术组比较，模型组大鼠BMD显著降低(P<0.05)；与模型组比较，藤黄健骨胶囊各干预组和西药对照组BMD均显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 藤黄健骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响Table 3 Effect of gamboge strong-bone capsule on bone mineral density in ovariectomized rats

注：与假手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.4 对骨生物力学参数的影响

与假手术组比较，模型组大鼠股骨的结构力学参数如最大载荷、断裂载荷等均明显下降(P<0.05)；藤黄健骨胶囊各干预组和西药对照组可明显改善去卵巢大鼠断裂载荷参数，藤黄健骨胶囊中、高剂量组和西药对照组可明显改善去卵巢大鼠最大载荷参数(P<0.05)。见表4。

表4 藤黄健骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨生物力学的影响Table 4 Effect of gamboge strong-bone capsule on biomechanical properties of the femur in

注：与假手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.5 股骨骨形态学影响

假手术组大鼠可见骨小梁排列规则、紧密、有序、结构完整、呈网状，密度、面积正常，骨小梁间隙较小；模型组大鼠可见骨小梁排列不规则，数量减少，结构稀疏，骨小梁丢失、断裂严重，骨小梁之间连接点较少，分布稀疏凌乱，间距增大；藤黄健骨胶囊高剂量组和西药对照组大鼠骨小梁明显增粗，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大。见图1。

图1 股骨病理形态学变化(HE，100×)Fig.1 The pathomorphological changes of the femur (HE, 100×)

3 讨论

大多数骨质疏松症患者为绝经后女性，其特点是雌激素水平下降[5]。目前，骨质疏松的经典治疗仍然选用激素替代疗法，西药戊酸雌二醇片是补充或替代雌激素分泌不足的一种处方药，主要用于由自然或人工绝经导致的雌激素缺乏病，但长期使用雌激素易增加患者患乳腺癌、子宫出血、心血管系统疾病等疾病的风险[6]。而中药治疗骨质疏松，具有安全、毒副作用小等优点[7]。

中医将骨质疏松归属于“骨痿”“骨痹”等范畴。中医认为，肾为先天之本，主骨生髓，肾精亏虚，骨髓生化无源，骨骼失养，发生骨折，认为肾虚是造成骨病的主要原因[8]，故治则以补肾为主。方中熟地黄滋补肾阴，骨碎补、肉苁蓉和淫羊藿补肾助阳，鹿衔草和鸡血藤补肝肾、强筋骨。诸药合用，具有补肾，活血，止痛的功效。

骨代谢生化指标中的骨形成标志物和骨吸收标志物能够动态地反映骨代谢情况。骨钙素(BGP)主要由成骨细胞合成并分泌，在骨形成受到抑制时BGP会降低，是评价骨形成和骨转换率的特异性指标[9]。抗酒石酸酸性磷酸酶(trACP)可由破骨细胞释放后进入血循环，骨吸收活跃时trACP会升高，是反映骨吸收的特异性指标[10]。本实验藤黄健骨胶囊各干预组和西药对照组血清BGP含量较模型组均显著升高，而藤黄健骨胶囊高剂量组血清StrACP 含量较模型组显著降低，提示藤黄健骨胶囊可影响骨代谢，其机制是通过促进骨形成、增强骨转化，抑制骨吸收实现的。

骨组织骨量、结构、形状及内在的生物力学等指标对骨组织的强度起决定作用[11]。骨密度(BMD)可以反映骨质量和骨强度，是一种可预测骨折危险性的敏感指标[12]。本实验藤黄健骨胶囊各干预组和西药对照组BMD明显增加，提示藤黄健骨胶囊可有效降低骨质疏松症骨折的发生率，其机制可能是通过增加BMD实现的。骨生物力学主要是研究骨组织在外界作用下的力学性能和骨在受力后的所产生的生物学效应，是评价药物对骨质量的指标[13]，骨量的减少以及骨质内部结构的改变均能影响骨生物力学，可降低生物力学强度。本实验结果显示，藤黄健骨胶囊各干预组和西药对照组断裂载荷参数较模型组明显升高；与此同时，藤黄健骨胶囊中、高剂量组和西药对照组最大载荷参数较模型组也明显升高，提示藤黄健骨胶囊通过改善骨生物力学的性能来防治骨质疏松。

骨的病理形态学观察是反映骨质疏松的病理组织状况的客观指标[3]。摘除女性卵巢后，骨的重建会加快，骨质丢失严重，骨小梁变薄，连接性中断、间隙变大，引发骨质疏松症。本实验结果显示，藤黄健骨胶囊高剂量组和西药对照组大鼠与模型组比较，骨小梁明显增粗，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大，说明藤黄健骨胶囊通过改善或修复骨组织的形态结构来防治骨质疏松。

总之，本实验通过体内动物实验证明了成年雌性SD大鼠卵巢切除后，BMD、BGP、最大载荷和断裂载荷等指标均明显降低，trACP含量明显升高，使骨吸收大于骨形成，造成骨代谢失平衡，最终导致骨质疏松发生。而藤黄健骨胶囊具有类雌激素的作用，可以拮抗上述骨质疏松的相关指标来发挥保护骨组织的作用。该研究结果为藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松的机制提供了理论依据。