五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠含量测定

白玉彬，董 朕，张吉丽，周绪正，张继瑜

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050）

五氯柳胺（Oxyclozanide）属于水杨苯胺类药物，是一种氧化磷酸化解偶联剂，可降低寄生虫体内三磷酸腺甙（ATP）的合成量，从而导致虫体因能量代谢紊乱而最终死亡［1］，该药对吸虫、绦虫和线虫均具有活性。为满足兽医临床的需求，本实验室自主研发了五氯柳胺口服混悬剂，采用焦亚硫酸钠作为五氯柳胺混悬液的抗氧化剂，以提高制剂的稳定性［2－5］。在溶液中焦亚硫酸钠会产生二氧化硫，从而生成亚硫酸盐对动物造成损害，控制焦亚硫酸钠的含量对提高产品的安全性具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent cary 100 UV－Vis （Agilent Technologies）；KQ－600DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPT－Ⅱ－40L优普超纯水制造系统（上海优普实业有限公司）；赛多利斯SQP电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

1.2 试剂

无水亚硫酸钠 （天津市滨海科迪化学试剂有限公司）；酸性品红（国药集团化学试剂有限公司）；冰乙酸（天津恒兴试剂）；结晶乙酸钠（天津市北辰方正试剂厂）；乙二胺四乙酸二钠（天津市大茂化学试剂厂）；五氯柳胺混悬液（实验室自制，批号20171102、20171103、20171104）。

1.3 溶液配置

1.3.1 酸性品红溶液的配制 精密称量酸性品红0.34 g，加入1 mL硫酸，加水稀释并定容至1 000 mL。

1.3.2 醋酸盐缓冲液（pH=4.8）的配制 称取结晶乙酸钠 136.1 g，乙二胺四乙酸二钠 0.4 g，加入冰乙酸57 mL。加水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.3 0.04%乙二胺四乙酸二钠溶液的配制 精密称量乙二胺四乙酸二钠0.4 g，加水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.4 无水亚硫酸钠对照品溶液的配制 精密称量无水亚硫酸钠10 mg，加入0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液稀释并定容至50 mL，配制成200 μg/mL作为储备溶液。精密量取储备溶液适量，依次使用0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液稀释为100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的对照品溶液。

1.3.5 供试品溶液的配制 精密量取1 mL五氯柳胺混悬液于100 mL容量瓶中，加入适量0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液，超声溶解，加0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液定容至100 mL。

1.3.6 辅料干扰溶液的配制 精密量取1 mL不含焦亚硫酸钠的五氯柳胺混悬液于100 mL容量瓶中，加入适量0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液，超声溶解，并定容至100 mL。

1.4 测定方法的建立

1.4.1 检测波长的选择 精密量取酸性品红溶液2mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，共4份，分别加入醋酸盐缓冲液1 mL（空白溶液）、辅料干扰溶液1 mL、50 μg/mL无水亚硫酸钠对照品溶液1 mL、供试品溶液1 mL，加醋酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀。以醋酸盐缓冲液为参比，在200～800 nm进行扫描。

1.4.2 反应时间的选择 精密量取酸性品红溶液2mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，加入50 μg/mL无水亚硫酸钠对照品溶液1 mL，加醋酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀。室温下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min， 测定上述溶液在548 nm处的吸光度，选择吸光度稳定的时间作为反应时间。

1.4.3 专属性试验 精密量取酸性品红溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，共2份，分别加入醋酸盐缓冲液1 mL（空白溶液）和辅料干扰溶液1 mL，加醋酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀。室温下放置45 min，分别在548 nm处测定吸光度。测得空白溶液和辅料干扰溶液的吸光度，观察辅料是否会对测定结果产生影响。

1.4.4 标准曲线 精密量取酸性品红溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，共7份，分别加入 100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的对照品溶液，加醋酸盐缓冲液定容，摇匀，室温下放置45 min。以醋酸盐缓冲液作为参比，测定上述溶液在548 nm处的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度的倒数为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.5 重复性试验 精密量取酸性品红溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，共6份，分别加入供试品溶液，加醋酸盐缓冲液定容，摇匀，室温下放置45 min。以醋酸盐缓冲液作为参比，测定上述溶液在548 nm处的吸光度。计算RSD，RSD不得大于2%。

1.4.6 回收率试验 精密称取4、5、6 mg无水亚硫酸钠于100 mL容量瓶中，加入0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液定容，摇匀，配制成 40、50、60 μg/mL 的对照品溶液。精密量取酸性品红溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，共3份，分别加入上述配制好的 40、50、60 μg/mL 的对照品溶液，加醋酸盐缓冲液定容，摇匀，室温下放置45 min。以醋酸盐缓冲液作为参比，测定上述溶液在548 nm处的吸光度。计算平均回收率及RSD。

1.5 样品含量测定

精密量取酸性品红溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸盐缓冲液，分别加入3批五氯柳胺混悬液供试品溶液，加醋酸盐缓冲液定容，摇匀，室温下放置45 min。以醋酸盐缓冲液作为参比，测定上述溶液在548 nm处的吸光度，按照标准曲线法计算3批样品中的焦亚硫酸钠含量。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

在200～800 nm处对空白溶液、辅料干扰溶液、对照品溶液、供试品溶液进行扫描，结果显示最大吸收波长为548 nm（图1至图4）。

图1 空白溶液扫描图谱

图2 辅料干扰溶液扫描图谱

图3 对照溶液扫描图谱

图4 供试品溶液扫描图谱

2.2 反应时间的选择

分别以 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min作为显色时间测定吸光度 （表1）。由表1可知，在0～25 min吸光度变化明显，而在40～60 min吸光度较稳定，故选择45 min作为反应时间。

2.3 专属性试验

在548 nm处测得空白溶液和辅料干扰溶液的吸光度均为0.875，表明处方中的辅料成分不干扰焦亚硫酸钠含量的测定。

2.4 标准曲线

分别在548 nm处测定一系列对照品溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度的倒数为纵坐标，绘制标准曲线（图5），得标准曲线方程为y=0.023 c＋0.868，R2=0.992。

2.5 重复性试验

按照供试品溶液配制方法配制6份样品溶液，在548 nm处测定吸光度（表2）。由表2可知，RSD为0.055 775%，证明其重复性较好。

2.6 回收率试验

在 548 nm 处测定 40、50、60 μg/mL 对照品溶液的吸光度 （表3）。由表3可知，平均回收率为97.09%，RSD 为 0.641 1%，证明该方法准确度高。

2.7 含量测定结果

按照上述焦亚硫酸钠测定方法，对3批五氯柳胺混悬液中的焦亚硫酸钠含量进行测定，结果见表4。从表4中可以看出，3批样品中的焦亚硫酸钠的含量均接近3.4 mg/mL，说明五氯柳胺混悬液性质稳定。

表1 不同显色时间溶液的吸光度

图5 标准曲线

表2 重复性试验结果

表3 回收率试验结果

表4 3批样品含量测定结果

3 小结与讨论

肝片形吸虫是寄生于肝脏胆管内所引起的一种较常见的人兽共患寄生虫病，该病分布广泛，在中国各地都有发生［6－8］，然而对于驱吸虫的药物研究与开发，近年来一直没有突破性进展。临床使用的药物，例如三氯苯达唑、氯氰碘柳胺等均已产生耐药性［9，10］。五氯柳胺作为一种抗肝片吸虫药，对于五氯柳胺的耐药性国内外还未见报道。五氯柳胺混悬剂研制成功，将对中国动物寄生虫病的防治发挥积极作用，尤其将改变中国在动物吸虫病防控中缺乏有效药物的局面，对促进畜牧业健康发展、保障公共卫生安全具有重要意义。焦亚硫酸钠作为五氯柳胺混悬液的抗氧化剂，能够有效降低五氯柳胺混悬液的氧化作用，使其含量保持稳定，使制剂能够达到长期储存的目的。但焦亚硫酸钠在溶液中会产生二氧化硫，从而生成亚硫酸盐，从而对动物造成损害，通过对抗氧化剂焦亚硫酸钠的含量测定，对于五氯柳胺的新药研发、应用以及食品安全控制具有重要的意义。

在反应时间的选择试验中，文献［2，4］中反应时间均在25 min，而本研究发现中，在25 min时，吸光度仍不稳定，证明酸性品红溶液中亚硫酸钠未能完全反应，而在45 min测定的溶液吸光度达到稳定状态，证明亚硫酸钠反应完全，所以将反应时间定为45 min。同时对样品溶液的加入量进行了筛选，固定酸性品红溶液为 2 mL， 分别加入 0.5、1.0、2.0、3.0 mL样品溶液，在548 nm处测定吸光度，结果发现，当样品加入量为 1.0 mL 时，吸光度在 0.2～0.8，测得的误差较小，所以将样品加入量定为1.0 mL。

在方法学验证中，连续对6份供试品溶液进行测定，测得吸光度RSD为0.055 775%，证明该方法重复性好；标准曲线为 y=0.023c＋0.868，R2=0.992，线性关系好；平均回收率为 97.09%，RSD 为 0.641 1%，证明该方法准确度高。通过分析方法结果验证来看，该方法专属性强、准确度高、线性关系好，可用于五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠含量的测定。