东北市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的分离鉴定、分型及耐药性分析

费 鹏赵胜娟姜亦超江 岩刘丽莉肖 枫张慧芸唐浩国康怀彬

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 长白山食品药品检验检测中心，吉林 白山 134500；3. 穆棱市食品检验检测中心，黑龙江 牡丹江 157500 )

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)是常见的食源性致病菌之一，主要存在于家畜家禽等动物体内，其中鸡是最易携带该致病菌的动物[1-3]。中国是鸡肉的消费大国，食用未煮熟的鸡肉是感染空肠弯曲杆菌的主要原因，感染该致病菌会导致患者腹泻、关节炎和格林-巴利综合征等疾病，严重地危害了消费者的健康[4-5]。空肠弯曲杆菌具有高度的遗传多样性，且对抗生素有较强的耐药性，给充分认识和有效控制该致病菌带来了难题[6-7]。

对空肠弯曲杆菌遗传多样性的研究有助于揭示特定环境中该致病菌的种群特征，增加对空肠弯曲杆菌的认识，该方向的研究已被研究者们关注[8-10]。陈荀等[11]利用脉冲场电泳技术对鸡肉产业链中(粪便、屠宰场中鸡肉)的空肠弯曲杆菌进行了分型研究，结果表明，83株供试菌株被分为了45个不同的分子型，揭示了鸡肉产业链中该致病菌的分子特征。脉冲场电泳技术的结果并不能揭示基因层面的信息，其结果也不能实现实验室之间的数据共享，而多位点序列分型(Multilocus Sequence typing，MLST)技术能够弥补上述不足[12]。Ma等[6]利用MLST技术对天津地区市售鸡肉中的空肠弯曲杆菌进行了分析，研究发现42株空肠弯曲杆菌被分成了22个不同的序列型(Sequence Type，ST)，并分析了不同STs空肠弯曲杆菌的系统发育关系。洪捷等[13]则利用MLST技术研究了分离自江苏地区空肠弯曲杆菌的种群特征，31株空肠弯曲杆菌被分成了21个STs。上述报道一定程度上揭示了禽肉及鸡肉产业链中空肠弯曲杆菌的遗传多样性，然而关于东北地区市售鸡肉中的空肠弯曲杆菌种群特征的研究尚未见报道。

目前，使用抗生素是治疗空肠弯曲杆菌感染最有效和常用的方法。然而，随着抗生素的滥用和长时间的使用，菌株很有可能产生耐药性。黄金林等[14]发现奶牛源的空肠弯曲杆菌具有多重耐药性。周倩等[15]分析了禽源的空肠弯曲杆菌的耐药性，发现了一株对92.6%的抗生素都具有耐药性的菌株。Yang等[9]发现长时间的红外突变处理能够显著地提高空肠弯曲杆菌杆菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素、强力霉素、氟苯尼考、氯霉素和庆大霉素的耐受性。这些研究表明，对空肠弯曲杆菌进行及时的耐药性监测是非常必要的。

本研究以东北地区市售鸡肉为研究对象，对其空肠弯曲杆菌的污染情况进行调查，利用MLST技术分析其遗传多样性，系统地揭示东北地区市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的种群特征。在此基础上，对分离株进行耐药性监测，以期为市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品采集：2017年1月～11月，采集东北地区市售的鸡肉样品1 000份，其中鸡胸肉和鸡翅各500份，用无菌棉签擦拭(3 cm×3 cm)，并保存在磷酸盐(phosphate buffered saline，PBS)缓冲液中，低温保存运往实验室；

溶菌肉汤(Lysogeny Broth, LB)、PBS缓冲液、脱纤维绵羊血、CCDA选择性培养基：青岛海博生物技术有限公司；

21种药敏纸片：北京兰伯瑞生物技术有限责任公司；

引物合成：苏州金唯智生物科技有限公司；

细菌全基因组DNA试剂盒、2×PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要仪器设备

高速台式离心机：GT10-1型，北京时代北利离心机有限公司；

高压灭菌锅：SANYO型，上海迭戈生物科技有限公司；

恒温培养箱：DNP-9272A型，常州诺基仪器有限公司；

电泳仪：BIO-RAD型，北京伯乐生命科学发展有限公司；

生物洁净工作台：BCW-1000型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；

PCR仪：Veriti®型，北京昊诺斯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 空肠弯曲杆菌的分离鉴定 根据周倩等[15]的方法，取100 μL PBS稀释液，对其进行分离纯化。挑取单菌落，接种在5%脱纤维羊血的LB肉汤培养基中，在微需氧(10% CO2，5% O2，85% N2)、37 ℃的条件下培养48 h。吸取空肠弯曲杆菌菌液2 mL，根据细菌全基因组DNA试剂盒说明书对其进行DNA提取，利用16S rRNA 测序技术进行鉴定。

1.3.2 看家基因PCR扩增及测序 按照Lévesque等[16]的报道合成引物(aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA)，以空肠弯曲杆菌 DNA 为模板，对其进行PCR扩增。扩增体系(50 μL)为：DNA模板2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，双蒸水23 μL。7对引物的反应体系相同，均为：94 ℃预变性10 min，30个循环(94 ℃，1 min；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min)，最后72 ℃延伸10 min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证，并对PCR产物进行基因测序分析。

1.3.3 空肠弯曲杆菌MLST分析 登陆空肠弯曲杆菌MLST数据库(http://pubmlst.org/campylobacter/)，将看家基因的基因测序结果在数据库中进行比对，得到7个看家基因的等位基因号，并根据7个等位基因号确定空肠弯曲杆菌的序列型(Sequence Type，ST)，并利用MEGA6.0软件对串序列进行最小似然系统发育分析。

1.3.4 空肠弯曲杆菌的耐药性分析 选取8种抗生素，利用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的K-B琼脂扩散法，分析空肠弯曲杆菌的耐药性。将活化的菌液稀释至0.5麦氏浓度，然后根据药敏纸片说明书进行测试，在微需氧、37 ℃ 的条件下培养48 h，根据抑菌圈直径的大小(mm)按CLSI/NCCLS评估空肠弯曲杆菌的耐药性。

2 结果与分析

2.1 东北地区市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的污染情况

东北地区1 000份市售鸡肉中共有62份空肠弯曲杆菌阳性样品，总污染率为6.2%，具体见表1。62份阳性样品中鸡胸肉样品37份(7.4%)，鸡翅样品25份(5.0%)，可见鸡胸肉中空肠弯曲杆菌的污染率高于鸡翅。东北5个不同地区市售鸡肉空肠弯曲菌的污染率分别为5.5%(A)、5.5%(B)、7.5%(C)、6.0%(D)、6.5%(E)。在2012年和2013年的调查中发现鸡肉中空肠弯曲杆菌的污染分别为11.5%[17]和1..66%[18]，本研究中东北地区市售鸡肉中该致病菌的污染率为6.2%，明显低于之前的污染率。

表1 东北地区市售鸡肉空肠弯曲杆菌污染情况†

Table 1 The contamination ofC.jejuniin commercial chicken in Northeast China

%

† 样品数为100。

2.2 东北地区市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的MLST分析

将62株空肠弯曲杆菌看家基因的序列在数据库中进行比对，得到看家基因等位基因号和ST，结果见表2。62株空肠弯曲杆菌被分为了14个ST，分别为ST1(15株)、ST5(24株)、ST28(2株)、ST52(4株)、ST64(4株)、ST88(3株)、ST90(1株)、ST236(1株)、ST456(2株)、ST751(1株)、ST905(1株)、ST1222(2株)、ST3228(1株)和ST3242(1株)，说明该致病菌具有较高的遗传多样性。其中ST5和ST1型的空肠弯曲杆菌分别占总菌株数的31.87% 和24.19%，是鸡肉中空肠弯曲杆菌的优势ST。在董俊等[19]的研究中显示分离自湖北地区禽类的空肠弯曲杆菌的优势ST353和ST464。这些与本研究的结果并不一致，是因为空肠弯曲杆菌的分离地区和来源不同，说明不同地区和来源的空肠弯曲杆菌在种群组成上存在差异。

表2 62株空肠弯曲杆菌MLST分析结果

2.3 不同ST空肠弯曲杆菌的系统发育分析

以不同ST的空肠弯曲杆菌看家基因串联序列为研究对象，利用MEGA6.0软件构建最小似然算法系统发育树，得到了清晰的系统发育关系，结果见图1。在14个不同的ST中，ST90和ST456，ST88和ST1222之间具有较近的系统发育关系，说明上述2组ST的菌株可能具有相近的生物学特性和侵染特性。ST3242明显远离了其他13个ST，说明ST324的空肠弯曲杆菌与其他菌株亲缘上有一定的距离，因此该菌株应该进行进一步的研究，确定其是否有独特的侵染和致病能力。

图1 不同ST空肠弯曲杆菌7个看家基因串联序列最小似然系统发育树

Figure 1 Maximum-likelihood tree of splicing sequence of 7 housekeeping genes inC.jejuniwith different STs

2.4 空肠弯曲杆菌耐药性分析

62株空肠弯曲杆菌对8种抗生素的耐药性分析结果见表3，在8种抗生素中对环丙沙星和复方新诺明的耐受率为0%，对其他6种抗生素的耐受率分别为91.94%(红霉素),88.71%(庆大霉素),74.19%(克林霉素),38.71%(青霉素),25.81%(四环素),6.45%(头孢噻肟)。这些结果表明空肠弯曲杆菌对大多数的抗生素都产生了耐药性，而所有的受试菌株都不耐受环丙沙星和复方新诺明，因此可以利用这2种抗生素预防和治疗空肠弯曲杆菌的感染。

表3 62株空肠弯曲杆菌耐药性分析

3 结论

本研究调查了东北地区市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的污染情况，其污染率为6.2%。62株空肠弯曲杆菌被分为了14个ST，分别为ST1、ST5、ST28、ST52、ST64、ST88、ST90、ST236、ST456、ST751、ST905、ST1222、ST3228和ST3242，其中ST5和ST1为优势的STs，说明空肠弯曲杆菌具有丰富的遗传多样性。抗生素耐药性分析表明空肠弯曲杆菌对环丙沙星、复方新诺明和头孢噻肟具有高度的敏感性，而对红霉素、庆大霉素、克林霉素、青霉素和四环素的耐受性较强。本研究的结果有助于了解东北地区市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的污染情况、种群特征和抗生素耐药性，为了进一步揭示环境对空肠弯曲杆菌种群特征的影响，接下来的研究将用更为先进的全基因组测序技术分析空肠弯曲杆菌的遗传进化特性，并挖掘与耐药性相关的功能基因。