发酵型桑葚果酒主要成分动态变化规律及香气成分分析

杨 芳刘 铁刘 燕王 沙王丹红

(1. 安康学院现代农学与生物科技学院，陕西 安康 725000；2. 陕西省蚕桑重点实验室，陕西 安康 725000；s3. 安康学院数学与统计学院，陕西 安康 725000)

桑葚营养丰富，具有良好的保健功能。相较于中国丰富的桑葚资源，目前围绕桑葚开发利用的产品数量、质量还远远不够。桑葚因其果肉多汁、香气幽雅、色素含量高且稳定是酿酒的极佳原料[1]。桑葚中黄酮类化合物具有增强毛细血管强度、抗自由基[2]、抗病毒[3-4]、抗炎、调节血脂、对抗膳食丙烯酰胺引发的细胞毒性等生物学活性[5]。果酒中有机酸含量的高低与果酒品质有着密切的关系[6]。有机酸具有抑菌、抗病毒、增加冠动脉流量、抑制脑组织脂质过氧化等作用。桑葚中有机酸以柠檬酸为主[7]。有机酸同时也是决定果酒口感的重要风味物质。乙醇是影响果酒香味和滋味的重要化学成分。乙醇含量过高，酒香盖住了果香。乙醇含量过低，不仅酒体缺失酒香，也缺少了酒类饮料特有的醇厚纯净。糖类物质是果酒发酵的主要成分，也是果酒中乙醇、有机酸产生的重要来源。果酒中残存的总糖成为衡量果酒品质的重要理化指标之一。

黄正勇等[8]的研究指出桑葚果酒发酵过程质量控制的3个要素分别为蔗糖添加量、酵母菌的选择及接种量、发酵温度及时间控制。前期研究利用星点设计—响应面优化的桑葚果酒发酵工艺发酵温度为15.3 ℃[9]，低于文献[8,10]报道的推荐温度20 ℃，酿制的桑葚果酒乙醇含量达14%[9]。本试验分析该工艺条件下桑椹果酒发酵过程中总糖、总酸、乙醇、总黄酮的变化规律，同时对该工艺条件下桑椹果酒香气成分进行分析，确定发酵总时间，以期为发酵型桑葚果酒的进一步开发提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 桑葚及酵母菌

桑葚：大十新鲜桑葚，产自陕西省安康市汉滨区张滩镇；

高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 仪器

气相色谱质谱联用仪：GCMS-QP2010型，日本岛津公司；

气相色谱仪：Agilent 7890A型，配Agilent DB-5气相毛细管色谱柱，美国Agilent公司；

微量冷冻高速离心机：Thermo Legend Micro17R型，美国Thermo公司。

1.3 试剂

石油醚、无水硫酸钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、冰乙酸：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；

硝酸铝：分析纯，天津市百世化工有限公司；

槲皮素：标准品，国药集团化学试剂有限公司；

无水葡萄糖：标准品，大连美仑生物技术有限公司；

甲醇、乙醇、三氯甲烷：色谱纯，天津益仁达化工有限公司。

1.4 方法

1.4.1 发酵工艺 桑葚清洗后沥干，粉碎后全果浆发酵。桑葚果酒发酵工艺条件：发酵温度15.3 ℃、接种量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g。发酵总时间为24 d。每3 d测1次，平行测3次，取平均值。

1.4.2 总糖含量的测定 采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)[11]。

1.4.3 总酸含量的测定 用邻苯二甲酸氢钾作基准物质标定NaOH溶液。发酵型桑葚果酒12 000 r/min离心10 min后，移取上清液2 mL至离心管。用NaOH标准溶液进行滴定，利用pH计来调节终点电位与预控电位。滴定终点电位是8.3[12]。记录此时消耗的氢氧化钠的体积。按式(1)计算发酵型桑葚果酒总酸含量。

(1)

式中：

s——总酸含量，g/L；

c——NaOH标准溶液浓度，g/mL；

k——柠檬酸系数[13]104；

v1——NaOH标准溶液消耗体积，mL；

v2——发酵型桑葚果酒上清液取样体积，L。

1.4.4 总黄酮的测定 采用聚酰胺吸附—硝酸铝显色法[13]105，以槲皮素为标准品[14]绘制标准曲线。

1.4.5 乙醇含量的测定 采用气相色谱法[15]。GC条件：DB-5气相毛细管色谱柱(30 m× 320 μm，0.25 μm)；进样口温度220 ℃；分流进样，分流比为20∶1；程序升温，40 ℃保持4 min，然后以3.5 ℃/min升至50 ℃，再以25 ℃/min升至200 ℃；检测器FID，检测器温度220 ℃，氢气流量30 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量11.5 mL/min；恒流模式，流速0.5 mL/min。

制作标准曲线：精密量取乙醇标准品稀释，使浓度分别成为0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mL/100 mL的系列对照品溶液，进样量1 μL，测定峰面积，按内标法以峰面积计算。

每个果酒样品取200 μL，用纯水稀释至10 mL后过滤上样，进样量1 μL。故计算时的稀释体积为50倍，每个样品处理2次分别进单针得到结果。

1.4.6 香气成分的检测 参考文献[13]128-129。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖含量的测定线性关系

葡萄糖标准液的浓度为1 mg/mL，以标准液的浓度0.000，0.008，0.016，0.024，0.032，0.04，0.048 mg/mL为横坐标，以其对应的吸光值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为Y=14.179X-0.000 7(R2=0.994 4)，表明在浓度范围内线性关系良好。

2.2 乙醇的测定线性关系考察

精密量取乙醇溶液，并进行稀释，使浓度分别成为0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mL/100 mL的系列对照品溶液，进样，测定。以乙醇体积百分比(X)对峰面积积分值(Y)进行线性回归，得回归方程y=2 669.819 277 0x+1.404 216 9,R2=0.999 978 1。乙醇标准品气相色谱图、桑葚果酒色谱图分别见图1、2。

2.3 槲皮素的测定线性关系考察

槲皮素标准品浓度为424.0 μg/mL，以标准品的浓度(0.00，8.48，16.96，25.44，33.92，42.40，50.88，59.36 mg/L)为横坐标，以其对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.007 2X-0.002 3(R2=0.999 7)，表明在浓度范围内(8.48～59.36 mg/L)线性关系良好。

2.4 桑葚果酒发酵过程中总糖、总酸、乙醇、总黄酮动态测定

桑葚果酒发酵过程中总糖、总酸、乙醇、总黄酮动态测定结果见图3。

由图3看出，发酵过程中总糖含量处于先迅速下降后趋于平缓的过程。发酵最初9 d糖的消耗量最大，最后慢慢趋于平缓。桑葚果酒发酵过程中，总酸含量变化呈现上升趋势，达到最大值后趋于相对稳定。在发酵第15～18天时样品的总酸含量介于5～6 g/L，第24天达到6.61 g/L。桑葚果酒总黄酮从发酵第15天的 274.83 mg/L增长到发酵第21天的最大值(417.19 mg/L)。

图1 乙醇标品色谱图

图2 桑葚果酒色谱图

2.4.1 总糖含量的变化 桑葚果浆中总糖是酿酒酵母菌生长所需的碳源。总糖的消耗量间接反映酿造过程酵母菌生长速度的变化历程。在桑葚果酒发酵最初阶段，酵母菌活性较好，大量消耗了试验中加入的蔗糖和桑葚本身所含的糖分。随着时间的推移，酵母菌活性不断下降，酵解速度趋于平缓，直至发酵完全。研究[16]38-39报道桑椹果酒发酵初始糖浓度会影响菌种对数生长期的出现时间。在桑葚汁初始糖浓度为180～280 g/L时，随桑椹果酒发酵初始糖浓度的增加，酵母菌对数生长期的出现时间会推迟。高浓度的初糖会阻遏乙醇脱氢酶产生，对果酒发酵有抑制作用，同时导致高渗透压，不利于酵母菌的生长。初糖浓度为180 g/L时桑葚汁酿造过程中酿酒酵母对数成长期在发酵第3天。本款桑葚果酒酿造初始糖浓度为202.78 g/L，发酵第3天降至35.10 g/L，表现出发酵第7天果酒总糖消耗最大。文献[6]报道桑葚果酒发酵第9天，桑葚果酒中的还原糖含量降低至原来的5%，降至发酵最低水平。

温度是发酵工艺控制的重要参数。桑葚果酒发酵温度多推荐在20 ℃左右[8,10]。酵母菌的接种量也是决定酵母菌是否能快速成为发酵优势菌的关键因素。接种量过少会导致发酵过程缓慢，酿造周期偏长；接种量过高会导致发酵过程过于迅速，不容易积累目标代谢产物。研究[17]报道最适的酵母接种量为5.00～7.00 g/L。本次发酵工艺参数中发酵温度15.3 ℃、接种量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g。在此工艺条件下，发酵1周后桑葚果酒总糖含量降低明显，最终桑葚果酒中残糖为(3.27±0.006) g/L。

图3 桑葚果酒发酵过程中总糖、总酸、乙醇、总黄酮含量变化

2.4.2 乙醇含量的变化 从发酵开始到第3天，乙醇浓度快速升高。果酒发酵至第15天乙醇含量迅速升高，于第18天达到新的平台值。在本款桑葚果酒发酵工艺条件下，乙醇的动态变化曲线呈现“S”型的特点。这可能与15.3 ℃ 发酵温度，低于酿酒酵母菌生长的最适温度20 ℃，导致最初发酵速度缓慢有关。在果酒发酵过程中，乙醇的大量积累会严重影响酵母细胞的生长，通过影响细胞形态、生理活动以及酶活性对酵母细胞产生胁迫。本款桑葚果酒酿造工艺由于最初发酵速度缓慢，乙醇浓度尚未对酵母菌的生长、发酵产生明显的反馈抑制，在发酵第18～24天乙醇含量稳定在14%左右。

2.4.4 总黄酮含量的变化 发酵过程中，桑葚果实中的黄酮逐渐释放，在微生物作用下大部分黄酮苷被降解为苷元，并溶于果酒中。

2.5 发酵型桑葚果酒的香气成分分析

桑椹果酒GC-MS所得到的总离子流图见图4、5。图中峰形、离子丰度和分离度均较好，满足分析的要求。将分离得到的单组份色谱峰对应的质谱图与NIST11谱库中质谱图进行检索匹配，分离得到的所有组分对应质谱检索相似度匹配率均>80%，鉴定结果列于表1、2中。

发酵第18天桑葚果酒香气成分检测到的醇类物质有10种，相对含量占43.5%；酸类物质有9种，相对含量占25.0%；酯类物质有8种，相对含量占16.1%；醛酮类物质相对含量占13.8%；3-烯丙基-6-甲氧基苯酚相对含量占1.6%。发酵第24天桑葚果酒香气成分检测到的醇类物质有7种，相对含量占34.5%；酸类物质有9种，相对含量占31.1%；酯类物质有6种，相对含量占12.7%；醛酮类物质相对含量占8.1%；高丝氨酸相对含量占7.7%；烷类物质相对含量占5.8%。其中有因具备愉快气味成为酯类香料的物质，如丁二酸二乙酯；呈椰子和鸢尾似香气和甜蜂蜡似风味的十四酸乙酯；呈微弱蜡香、果爵和奶油香气十六酸乙酯；呈鲜花香气的十八烯酸乙酯；略呈蜡香的十八酸乙酯。可以被用作食用香料的酸类物质如2-甲基丁酸、丁酸、己酸、苯甲酸、棕榈酸。3-羟基-2-丁酮被高倍数稀释后会产生香甜的奶香气，在酒类调香中占有重要地位。甘油醛是酵母菌糖酵解过程产生的中间代谢物，有一定的甜味，作为风味物质。莽草酸既可以作为保香物质，还具备一定药用活性。该物质通过影响花生四烯酸代谢，发挥抑制血小板聚集作用，从而抑制动、静脉血栓形成。亚油酸乙酯和亚油酸，尤其是亚油酸乙酯，均具备降低胆固醇和血脂的作用，对动脉粥样硬化症有预防保健作用。未检测到酒香酵母菌产生的具有马厩味的4-乙基苯酚，脂肪臭味的异戊酸等影响果酒香气的成分。

图4 桑葚果酒发酵第18天香气成分GC-MS总离子流色谱图

图5 桑葚果酒发酵第24天香气成分GC-MS总离子流色谱图

比较第18天和第24天果酒香气成分，均以醇类和酸类构成香气成分的主体，其中酯类含量相对较少。第24天果酒香气成分相较第18天，醇类物质相对含量降低，酸类物质相对含量增高，酯类物质相对含量降低。发酵第18天果酒中含有正己醇和异丁醇2种高级醇，相对含量较少，可以赋予发酵型桑葚果酒芳香气味，提供丰富饱满的口感。北京、河北、云南不同产地桑葚酿造的果酒香气成分分析报道中，不同产地的桑葚果酒香气成分醇、酸、酯之间的比例差异较大[18]。本次发酵工艺条件下，桑葚果酒香气成分醇、酸、酯之间的比例与文献[18]报道的河北产地桑葚果酒比较接近。气相色谱-质谱联用技术因其所具有的强大富集、分离和定性能力成为桑葚果酒香气成分鉴定领域最有效的分析手段。目前，样品前处理方法主要选用溶剂萃取法和顶空固相微萃取法。在检索到的桑椹果酒香气成分文献中，桑葚果酒香气成分差异较大。桑葚原材料、酵母菌种、发酵工艺、陈酿时间等因素的不同均会导致桑葚果酒香气成分的检测结果出现差异。一方面是参与贡献桑葚果酒香气的醇类、醛酮类、酯类、酸类、苯环及酚类、烷类各自所占百分比不同。另外，每款果酒的主要香气成分组成也存在差异，除苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯外，其他组分各不相同。在检索到的桑葚果酒香气成分文献中[13]126-128[18-19]，被重复检测到的醇类物质包括2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、苯甲醇、己醇、壬醇、2，3-丁二醇；被重复检测到的酸类物质包括己酸、乙酸、2-甲基丁酸、癸酸、油酸；被重复检测到的酯类物质包括乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯、癸酸乙酯、亚油酸乙酯、辛酸乙酯。对照桑葚汁香气成分[13]122-124[18-20]，同时在桑葚果汁和桑葚果酒中被重复检测到的醇类物质包括苯乙醇、己醇；被重复检测到的酸类物质包括己酸、乙酸、丁酸、亚油酸、棕榈酸；被重复检测到的酯类物质包括乙酸乙酯、十六酸乙酯、十四酸乙酯、癸酸乙酯、亚油酸乙酯、辛酸乙酯。

表1 桑葚果酒发酵第18天香气成分分析

表2 桑葚果酒发酵第24天香气成分分析

关于酒体香气成分中乙醇的检出，不同的文献[19,21-22]报道结果有差异，文献[19]检测出桑葚果酒中的乙醇，其他均未报道。这可能与样品的前处理方法以及和质谱检测的动态范围有关，含量达不到或者超过检测范围均不被检测到。

3 结论

从桑葚果酒发酵主要成分动态变化规律来看，在发酵温度15.3 ℃、接种量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g的工艺条件下，发酵总时间可以缩短到18 d，果酒中残存的总糖、总酸、乙醇含量均在较佳范围，但总黄酮处于上升期，尚未到达最大值。本款发酵型桑葚果酒醇类和酸类构成香气成分的主体，其中酯类含量相对较少，赋予了本款发酵型桑葚果酒主要香气特征。