我国12个地区草莓叶螨种类分子鉴定及遗传多样性

曹利军, 周晓怡,2, 宫亚军, 魏书军*

(1. 北京市农林科学院植物保护环境保护研究所, 北京 100097; 2. 长江大学农学院, 荆州 434025)

草莓具有非常丰富的营养价值,我国草莓栽培面积超过10万hm2,年产量超过270万t,年产量和栽培面积超过了世界总量的1/3,现稳居世界第一位[1]。随着草莓的广泛种植,害虫为害也日渐严重。叶螨是草莓上为害最为严重的害螨,直接影响草莓的产量和品质。受叶螨为害的草莓植株会矮化早衰,叶片变褐色及干枯,开花期受害植株的果实缩小,且畸形果增多,草莓的品质严重下降[2]。叶螨具有个体微小、世代周期短和繁殖力强等特点,在实际生产中频繁用药和不合理用药等导致叶螨抗药性产生迅速[3-5]。前人的研究认为草莓上有多种叶螨,包括二斑叶螨Tetranychusurticae[6]、截形叶螨Tetranychustruncates[7]、朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus[2]和神泽叶螨Tetranychuskanzawai[8]等。随着草莓种植面积的逐年扩大、农药的大量使用以及耕作制度的改变,草莓上主要叶螨种类是否发生了变化？明确这一问题对于制定合理的叶螨防控策略,提高防治效果有重要参考价值。

然而,不同种类叶螨的卵、若螨和成螨均缺少差异明显的形态特征,并且形态特征易受性别和发育阶段的影响,通过形态鉴定叶螨种类存在较大困难[9-10]。基于DNA序列的分子鉴定技术是一种准确又快速的鉴定叶螨种类的方法,其中线粒体基因cox1序列、核糖体转录间隔区2(ITS2)序列和限制内切酶片段长度多态性技术(RFLP)等是叶螨分子鉴定的常用标记[9-11]。本研究采用了通用引物容易获得、扩增成功率较高的cox1序列对我国草莓主要产区的叶螨种类进行了快速鉴定,并分析了叶螨种群的遗传多样性。

1 材料与方法

1.1 标本采集与DNA提取

供试叶螨样本来自全国12个草莓产区(表1),覆盖了我国华北、华中、华东和西南的草莓产区,且在空间上分布均匀。采集标本时,每个样点采3～5片带有叶螨的草莓叶片放入自封袋,每个地区采集15个以上样点,每个样点间距5 m以上。将每个自封袋中的叶螨标本挑入1个装有无水乙醇的2 mL离心管中,-80℃保存用于提取DNA。

表1草莓叶螨样本采集信息

Table1Samplinginformationofthestrawberryspidermites

采集地点Location经纬度Lat, Lon采集时间/年-月Date检测样本数/个Sample size北京延庆北菜园40°32'13.2″N, 116°9'57.6″E2017-048北京昌平万德园40°13'19.2″N, 116°12'57.6″E2017-038北京平谷夏鱼路40°10'44.4″N, 117°13'58.8″E2017-058山西阳泉盂县苌池镇小独头村35°50'6″N, 113°21'36″E2017-038河北衡水庞庄村37°44'49.2″N, 115°41'9.6″E2017-038山东日照莒县棋山镇三庄村35°50'6″N, 118°54'10.8″E2017-038安徽淮南市潘集区后湖生态园32°48'32.4″N, 116°51'39.6″E2017-035上海市浦东新区苗桥路31°8'9.6″N, 121°37'58.8″E2017-048浙江嘉兴市嘉善县魏塘街道智果村30°53'2.4″N, 120°56'24″E2017-058四川成都贵和农业公园30°40'48″N, 104°4'4.8″E2017-038江西南昌八一乡涂家村28°34'15.6″N, 115°57'3.6″E2017-058湖南长沙市长沙县三兴村28°2'20.4″N, 112°57'46.8″E2017-048

在显微镜下初步观察叶螨形态,从每个种群选取5～8头个体色有差异或空间上相距较远的成螨提取DNA,共计93头成螨。提取过程为:将单头叶螨放入含有10 μL裂解缓冲液的0.2 mL的PCR管中,并使用烧制过的移液器吸头尖端挤压碾碎,使组织在裂解缓冲液中消解,短暂离心后将PCR管放置在-80℃下30 min,随后在金属浴65℃下孵育1 h,最后在95℃下保持15 min[12]。其中组织裂解液配方为:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2),50 mmol/L KCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.45%Tween-20,0.01%明胶,60 μg/mL蛋白酶K[12]。

1.2 基因序列的PCR扩增

PCR反应体系总体积为15 μL:buffer (Mg2+) 1.5 μL,dNTPs 1.5 μL,上下游引物各0.3 μL,LATaq酶0.2 μL,模板DNA 2 μL,加ddH2O补充总体积为15 μL。本研究先后使用了2对引物进行扩增,先使用引物LEPF1/LEPR1进行PCR扩增,扩增不成功的样品用自己设计的引物AF-TU/AR-TU进行扩增。LEPF1/LEPR1是参考Hebert等[13]的引物并修改,上游引物为LEPF1:5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3′,下游引物为LEPR1:5′-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAA-TCA-3′;AF-TU/AR-TU是根据GenBank数据库登记的叶螨序列重新设计的引物,上游引物AF-TU:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,下游引物AR-TU:5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性30 s,44℃退火30 s,60℃延伸1 min,35个循环;最后修复延伸10 min。PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行双端测序。

1.3 测序和序列分析

将测序序列用MEGA 7.0121软件进行比对[14]。使用DnaSP 5.0分析叶螨cox1基因的单倍型数,计算多样性参数[15]。将DnaSP 5.0分析得到的不同单倍型在GenBank数据库中用BLAST工具进行搜索。

从GenBank数据库下载Tetranychus属的cox1序列,所选取序列包含本研究所测定区域。下载的数据在同行评审期刊上发表的论文里使用过,或者序列对应的标本经叶螨分类专家鉴定。来自同一个国家的相同序列,只保留一个。通过MEGA 7.0121软件[14],利用邻接法(neighbor-joining, NJ)[16]构建基于Kimura双参数模型(Kimura-2-parameter, K2P)[17]的系统发育树,重复1 000次bootstrap检验[18],计算各个节点的支持率。

2 结果与分析

2.1 cox1基因PCR扩增

除浙江嘉兴地区的2头叶螨未能扩增得到序列外,其余地区选取的样本均成功获得cox1基因序列,共获得91个样品的cox1序列。其中,LEPF1/LEPR1从81头叶螨中扩增到目的片段,AF-TU/AR-TU从10头叶螨中扩增到目的片段。

2.2 物种鉴定

PCR扩增产物经测序后,得到的cox1基因部分序列的长度为632 bp。DnaSP 5.0分析表明,草莓上的叶螨有2种单倍型。将2种单倍型序列在GenBank数据库中进行BLASTn比对,结果(图 1)表明:其中一种单倍型序列(包含86个个体)与GenBank数据库中的二斑叶螨绿色型序列(GenBank序列号:KJ729022)[19]相似度为100%,命名为单倍型a (hap a);另一种单倍型与单倍型a相比,有1个核苷酸的同义(GGA/GGG)突变,与二斑叶螨绿色型序列相似度大于99.8%,命名为单倍型b (hap b)。系统发育分析表明,2种单倍型与二斑叶螨绿色型聚为一支,和二斑叶螨红色型有较近的亲缘关系,而与其他叶螨的遗传距离较远。分子鉴定结果明确了我国草莓上的叶螨均为二斑叶螨绿色型。

图1 基于cox1序列构建的叶螨NJ系统发育树Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree of the spider mites based on cox1 gene sequences

2.3 遗传多样性

使用DnaSP 5.0统计cox1序列多样性,发现单倍型a存在于所有的种群中,而单倍型b仅在北京昌平种群中的5个个体中发现(图1)。单倍型b在其他研究中尚未报道过。结果表明,我国草莓上二斑叶螨线粒体cox1基因的遗传多样性非常低。

3 讨论

二斑叶螨原在欧洲和美国普遍发生,20世纪80年代以前在我国未曾发现。1983年,在北京市天坛公园花卉上首次发现了二斑叶螨[20],随后在1990年和1991年在河北昌黎、甘肃天水的果树上相继被发现[21]。1994年,二斑叶螨在我国仅局部分布于台湾岛、北京市和天水市郊[22]。此后,以上述各地区域为中心,向其他地区扩散。有研究认为,二斑叶螨在我国主要分布于东北、华北、西北及苏皖两省北部[6],在海南和广东的作物上没有分布[5],但有研究者在我国南方的广东和四川也发现了二斑叶螨的危害[23]。本研究在四川成都、江西南昌和湖南长沙均采集到了草莓上二斑叶螨的样本。此外,Sun等[24]对二斑叶螨种群遗传学的研究中也采集到我国南方的多个二斑叶螨种群,例如在湖南长沙(寄主为豇豆)、江西九江(棉花)、浙江慈溪(棉花)和云南玉龙(菜豆)。本实验室在调查过程中,在海南豆角上也发现了二斑叶螨(未发表),由此可见二斑叶螨在我国南方已经建立了稳定的种群,分布范围进一步扩大。

二斑叶螨主动扩散的能力有限,但可以凭借风力、流水、昆虫、鸟兽和人畜等多种途径进行传播,其中农具和花卉苗木携带是二斑叶螨长距离传播的主要途径[24]。近年来对入侵物种的研究表明,种群遗传学研究方法是分析入侵物种传播扩散过程的有力手段[25]。本研究采集的样本包括我国12个地区草莓上的叶螨种群,南北最远相距1 500多公里,东西横跨近2 000公里。但是只发现了2种线粒体单倍型,其中绝大多数地区只有1种单倍型。这可能反映了我国二斑叶螨的起源种群比较单一,入侵到我国之后随种苗调运发生了二次传播。而北京昌平具有2种单倍型,可能反映了该园区的种苗调运较为复杂。实际上该园区草莓品种较多,有很多直接从国外引进的品种。

从20世纪90年代开始国内学者开始关注为害草莓的叶螨,包括朱砂叶螨和神泽叶螨[2,8]。本研究发现我国草莓主要产区为害草莓的叶螨只有二斑叶螨,未发现神泽叶螨。由此推断二斑叶螨可能已经成为这些地区为害草莓的优势种。出现这种情况的原因,可能是作为入侵种的二斑叶螨比本地种适应能力更强,其入侵扩散导致了对当地相似生态位的物种的取代[26];也可能是二斑叶螨经过长期的药剂筛选后逐渐取代了其他叶螨,从一种次要害螨上升为主要害螨[27]。另外,耕作制度和栽培模式的变更,可能创造了更加适宜二斑叶螨生存的环境。

本研究明确了我国草莓上的主要叶螨种类为二斑叶螨,对于制定草莓害螨防治策略,减少农药滥用,管理叶螨抗药性等具有重要的指导意义。