悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

董 敏, 杜立啸, 袁洪振, 夏延颖, 司军红, 董文慧

(1. 山东鸿林工程技术有限公司, 济南 250101; 2. 中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)

悬铃木方翅网蝽Corythuchaciliata属半翅目网蝽科,原分布于北美和加拿大中东部[1],1964年经意大利在欧洲迅速蔓延[2-3]。目前在南美洲、亚洲和澳洲也已发现大面积为害现象[4-5]。我国在2006年于武汉首次发现悬铃木方翅网蝽,随后在上海、杭州、南京、重庆、武汉等长江流域多个城市发生危害,形成了暴发态势[6]。国家林业局随即将悬铃木方翅网蝽增列入我国林业危险性有害生物名单,并要求各地监测和防治。悬铃木方翅网蝽具有传播速度快、为害严重等特点,被认为是危险入侵物种,一旦传入到新的地区,短时间内可形成稳定的高密度种群[7-10],成为入侵地悬铃木的常发性主要害虫[11-13],暴发时难以控制[14]。悬铃木是我国常见的城市绿化植物,广泛种植于中东部地区,具有特殊的美化和人文价值,悬铃木方翅网蝽严重影响着城市形象,给居民生活和城市管理带来了巨大困扰,因此急需寻找一种安全有效的防治方法。

嗅觉对昆虫的生存繁衍至关重要,它在昆虫寻找食物、配偶、产卵和发育场所、躲避敌害等方面发挥重要作用[15-16]。气味受体(odorant receptor)是嗅觉系统的关键成分之一,是了解昆虫化学信号分子识别机制的重要基础[17-19],对气味受体的研究可为悬铃木方翅网蝽的防治提供新的思路和途径。本研究采用RT-PCR技术,克隆获得悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因,利用生物信息学技术对其序列进行分析,并与其他昆虫Orco基因同源性进行了比较,以期为进一步研究悬铃木方翅网蝽嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试样本与试剂

悬铃木方翅网蝽成虫采自山东省济南市历城区郭店镇相公庄区域山东鸿林工程技术有限公司的苗圃园内。将采集到的成虫存放于白色透明塑料盒中,用新鲜悬铃木叶片饲喂,放置于人工培养箱中,温度(27±1)℃、湿度60%。取300头成虫的触角,用镊子将其头和触角一同夹下,立刻置于液氮中研磨至粉状,转入装有1 mL TRIzol的EP管中,-70℃保存至RNA提取。

总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司;First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司;PCR试剂购自TaKaRa公司;普通琼脂糖胶回收试剂盒、感受态细胞、pEASY-Blunt Vector、抗生素类、X-gal、IPTG均购自全式金生物技术有限公司;GoTaq qPCR Master Mix购自Promega公司;其他均为国产或进口分析纯试剂;引物合成、测序由华大基因生物技术公司完成。

1.2 引物设计

根据GenBank 中已发表的半翅目昆虫中黑盲蝽Adelphocorissuturalis(GenBank: KC881257)、绿盲蝽Apolyguslucorum(GenBank: KC881255)、豆荚草盲蝽Lygushesperus(GenBank: JQ639213)、美国牧草盲蝽Lyguslineolaris(GenBank: JQ639214)等非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列,设计扩增悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因的简并引物,上游引物:5′-ATGATGACCAARGTGAARGC-3′;下游引物:5′-TTAYTTGAGYTGTAYCAAYACCATG-3′。

1.3 总RNA提取和cDNA的合成

使用TRIzol试剂提取1.1节中收集的悬铃木方翅网蝽成虫头部和触角的总RNA,提取步骤参照说明书。提取的总RNA浓度和质量通过NanoDrop-2000(NanoDrop Products)和琼脂糖凝胶电泳检测。取1 μg总RNA,以Oligo dT为引物合成cDNA,试验操作依照First Strand cDNA Synthesis Kit使用手册。

1.4 基因克隆

以悬铃木方翅网蝽头部及触角cDNA为模板,利用简并引物扩增CcilOrco的完整开放阅读框序列。反应体系为:2×PrimeStar Premix 25 μL,cDNA 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,ddH2O补充至50 μL。混匀,短暂离心,放入PCR仪中进行扩增。反应条件:94℃预变性5 min;接着进行35个循环,循环条件为94℃ 15 s,55℃ 20 s,72℃ 45 s;最后72℃延伸5 min。将产物于1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。将回收的PCR产物连接到pEASY-Blunt克隆载体并测序。

1.5 序列分析

通过DNAMAN、Gendoc等软件对测序获得的悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行分析;利用NCBI上BLAST工具进行同源性比对;使用EXPASY(Expert Protein Analysis System,http:∥www.expasy.org)的Translate tool(http:∥web.expasy.org/translate)将核酸序列翻译成氨基酸序列,通过Compute pI/Mw工具(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)预测蛋白分子量和等电点。使用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk /services /TMHMM)进行跨膜结构域预测。使用Mega 6.0采用邻接法(neighbor-joining method)构建进化树,分支的支持率通过bootstrap验证,重复次数1 000。

1.6 CcilOrco 基因表达分析

为了明确CcilOrco基因在雌雄成虫不同部位表达量的差异,我们利用qPCR对该基因在雌雄成虫触角、头(去除触角)、胸、腹、足中的表达情况进行了分析。根据获得的CcilOrco基因的核酸序列,利用Primer 5设计特异引物,上游引物:5′-CTTCTGTTTCATTCGTCATATTTGCC-3′;下游引物:5′-ATCGTTTCCATCCCCATTGGTA-3′。内参基因选用β-actin(GenBank: KX108734) 基因,上游引物:5′-CCAAGGCCAACAGAGAAAAGAT-3′;下游引物:5′-GATGGGCACAGTGTGGGAAA-3′。

收集200头雌、雄成虫的触角, 200头雌、雄成虫的头(去除触角), 100头雌、雄成虫的胸,50头雌、雄成虫的腹,50头雌、雄成虫的足,液氮中研磨至粉状,转入装有1 mL TRIzol的EP管中,-70℃保存至RNA提取,RNA提取的方法步骤同1.1。所有部位均取 1 μg 的RNA进行cDNA 的合成,具体步骤同1.3。qPCR反应体系为:GoTaq qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,cDNA 1 μL,无RNA酶的H2O 7.4 μL。反应程序为:95 °C,2 min; 95 °C,15 s,60 °C,50 s,循环数为40。整个反应在ABI 7500 Fast平台上完成。将雌性成虫触角cDNA以10倍浓度进行梯度稀释,共8个浓度,并以此为模板进行qPCR扩增,以确定引物的特异性及扩增效率。每个部位独立重复3次。数据采用2-ΔΔCT法进行处理,采用SPSS 16.0进行ANOVA比较不同组织间CcilOrco基因表达量的差异(LSD,P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 悬铃木方翅网蝽气味受体基因CcilOrco序列分析

通过基因克隆获得悬铃木方翅网蝽气味受体基因的序列,命名为CcilOrco(GenBank:MF564288)。如图1所示。

图1 悬铃木方翅网蝽CcilOrco核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of the gene CcilOrco in Corythucha ciliate

CcilOrco开放阅读框长1 419 bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25 kD,等电点为6.22。利用TMHMM 2.0蛋白跨膜结构预测软件分析,获得的序列具有7个α螺旋跨膜区(图2),跨膜区氨基酸的位置是47-69,74-96,135-157,204-226,344-366,376-398 和446-468,是一个典型的G蛋白偶联受体,序列N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。

2.2 悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因氨基酸同源性比较

选取半翅目昆虫绿盲蝽(AlucOrco:KC881255)、美国牧草盲蝽(LlinOrco:JQ639214);双翅目昆虫黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(DmelOrco: AY567998)、冈比亚按蚊Anophelesgambiae(AgamOrco: AY843205);鳞翅目昆虫黄地老虎Agrotissegetum(AsegOrco:

KC526964)、桃蛀螟Conogethespunctiferalis(CpunOrco: JX101681)与悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因进行序列比对分析,结果显示,这8种昆虫的Orco受体的C端序列具有高度的保守性(图3)。

图2 悬铃木方翅网蝽CcilOrco的跨膜结构预测Fig.2 The predicted transmembrane domains of the olfactory co-receptor CcilOrco from Corythucha ciliate

图3 悬铃木方翅网蝽CcilOrco与其他昆虫气味受体蛋白的序列比对Fig.3 Sequence alignment of Corythucha ciliate CcilOrco with olfactory receptors in other insects

为研究悬铃木方翅网蝽CcilOrco与其他物种之间的进化关系,利用Mega 6.0软件邻接法构建半翅目、鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目、双翅目部分昆虫非典型气味受体的系统进化树(图4)。结果显示,24个非典型嗅觉受体基因分成2个大的分支,不同目之间氨基酸序列差异较大,同一目昆虫之间差异较小;悬铃木方翅网蝽CcilOrco与麦长管蚜SaveOrco、绿盲蝽AlucOrco、豆荚草盲蝽LhesOrco、美国牧草盲蝽LlinOrco聚为一类,它们都属于半翅目昆虫非典型气味受体,相似性较高。而与其他目昆虫遗传距离较远,相似性很低。

图4 悬铃木方翅网蝽与其他昆虫Orco氨基酸的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Corythucha ciliate Orcos and those from other insects based on amino acid sequence

2.3 悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因在不同部位表达分析

采用qPCR对悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因在雌雄成虫不同部位的表达情况进行了比较分析。以雌成虫触角不同浓度的cDNA为模板,进行qPCR,根据CT值得到悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因和β-actin基因的标准曲线,其相关系数r分别为0.999 6和0.999 7,扩增效率分别为102%和103%,符合试验的要求。

以雌虫和雄虫足中CcilOrco基因的表达量为1,分别对雌虫和雄虫其他部位中获得的数据进行处理。结果显示,CcilOrco基因在雌性和雄性成虫之间表达模式一致,均在触角中表达量最高,显著高于其他部位;其次为头部,在胸、腹和足中的表达量最低,且三者之间不存在显著性差异(图5)。

图5 悬铃木方翅网蝽CcilOrco的表达分析Fig.5 Expression profile of CcilOrco in different parts of Corythucha ciliate

3 结论与讨论

目前,随着测序技术的发展,多种昆虫的触角转录组被测定出来,利用昆虫各物种之间的保守区域进行同源克隆的方法,已从鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目等8个目的多种昆虫发现了非典型气味受体基因,并且在不同昆虫之间其序列相似性很高。本研究通过RT-PCR技术获得悬铃木方翅网蝽CcilOrco基因的cDNA序列,其编码的氨基酸序列与半翅目昆虫麦长管蚜SaveOrco、绿盲蝽AlucOrco、豆荚草盲蝽LhesOrco、美国牧草盲蝽LlinOrco等同源性水平很高,与双翅目等昆虫的非典型气味受体也有高的同源性,这些都与Orco基因在不同昆虫体内的保守性相吻合。通过qPCR发现CcilOrco基因主要在雌雄成虫触角中高表达,在去除触角的头部表达量同样显著高于胸、腹和足等非嗅觉组织。这可能和其与ORx的共表达有关,目前的研究发现,绝大部分ORx主要在触角、喙、下唇须等嗅觉组织中表达。

Orco与普通气味受体ORx共表达,形成一个异源二聚体结构,这样可以极大地提高ORx对气味的结合反应能力,但它对ORx的配体结合范围并无任何影响[20-22]。Larsson等[23]敲除果蝇Orco后发现,果蝇对大部分气味的电生理反应丧失,同时这些气味也无法引起果蝇相应的行为反应;但进行基因营救试验后,果蝇对这些气味的电生理反应和行为反应又得到了恢复。类似的研究在赤拟谷盗、黄曲条跳甲等昆虫的Orco中也得到了相似的结果[24]。Orco在昆虫嗅觉识别过程中发挥着重要的作用,但其本身并不与任何配体结合。在对果蝇Or22a/b基因突变体中,只表达Orco的嗅觉神经神经元对测试的气味化合物无任何生理学反应[25]。

目前已被证实,VUAAI是Orco的兴奋剂,它可以通过激活Orco从而激发几乎所有嗅觉神经元的活性,进而丧失对不同气味物质的区分,抑制昆虫嗅觉诱发的行为反应[26]。随后的研究也发现了多种Orco的抑制剂[27-28],这些研究为以Orco为靶标的害虫防治提供了基础。本研究对悬铃木方翅网蝽气味受体CcilOrco基因的成功克隆,为悬铃木方翅网蝽的防控提供新的理论基础,具有重要的实践意义。