番鸭Viperin基因的克隆表达及其抗MDRV的作用研究

陈洁滢， 孙亚楠， 邵文涵， 池晓娟， 陈吉龙， 王 松

(福建农林大学动物科学学院， 福建 福州 350002)

番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(MDRV)引起的一种以脚软、肝脾有大量白色坏死点、高发病率和高病死率为特征的新的急性传染病，对番鸭养殖业造成极为重大的经济损失。机体天然免疫系统是抗病毒感染的第一道防线，病毒感染宿主后，天然免疫系统会被激活，经细胞中一系列的信号传导，诱导宿主分泌多种抑制病毒的细胞因子。干扰素(Interferon，IFN)是最重要的细胞因子之一，在抵抗病毒的过程中发挥着重要作用，干扰素可以与细胞表面的特异性受体结合，进而诱导上千种干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表达[1]。MDRV感染后能迅速激活宿主天然免疫信号通路，诱导IFNs及某些重要ISGs的大量表达[2]。从ISGs被发现以来，国内外学者不断探索ISGs在病毒侵袭宿主过程中发挥的作用及作用机理，目前对包括Viperin在内的少数ISGs的抗病毒机制有较深入的了解[3]。

Viperin，也被称为cig5和RSAD2，是一种重要的ISGs，是与内质网相关的抗病毒蛋白，可被干扰素、细菌脂多糖(LPS)、poly ( I ∶ C) 和多种病毒等诱导表达，具有广谱抗病毒活性[4]，对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)[5]、丙型肝炎病毒(HCV)[6]、登革热病毒(DENV)[7]、基孔肯雅病病毒(CHIKV)[8]、仙台病病毒(SeV)[9]、A型流感病毒(IAV)[10]、日本脑炎病毒( JEV)[11]、人类免疫缺陷病毒(HIV)[12]和西尼罗河病病毒(WNV)[13]等多种病毒具有抑制作用。但目前还未有文献报道番鸭Viperin蛋白在番鸭体内的表达情况，以及其对MDRV复制影响的相关研究。本研究首先检测了番鸭Viperin基因在感染MDRV细胞和雏番鸭组织中的表达情况；然后，克隆番鸭Viperin 基因到真核表达质粒，并对Viperin在MDRV复制中的作用进行了研究。本研究首次证实番鸭Viperin蛋白具有抗MDRV的作用，为抗MDRV药物的筛选和研制提供了新的选择，也为番鸭Viperin 蛋白抗病毒活性的初步评价提供了依据。

1 材料

1.1 细胞、病毒、实验动物和菌株 293T细胞，由本实验室保存；番鸭鸭胚成纤维细胞(MDEF)，分离自11～13日龄的番鸭胚；MDRV病毒YB株，由福建农林大学动物科学学院吴宝成老师惠赠；番鸭购自广东温氏食品集团有限公司莆田分公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自天根生化科技( 北京) 有限公司。

1.2 培养基及主要试剂 DMEM、胎牛血清，Gibco 公司生产； 核酸限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 连接酶、Pyrobest 高保真DNA 聚合酶、Taq酶、Oligo d( T) 18 Primer、Recombinant Dnase I、Cloned Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、核酸Marker，均由TaKaRa 公司生产；真核转染试剂VigoFect，威格拉斯生物技术有限公司生产；NC膜，Millipore 公司生产；蛋白预染Marker，Thermo Scientific 公司生产；ECL 化学发光液，普利莱基因技术有限公司生产；Flag 标签抗体、过硫酸铵和十二烷基磺酸钠，均由Sigma 公司生产； 羊抗鼠二抗，Santa Cruz 公司生产；丙烯酰胺，国药集团化学试剂有限公司生产。

1.3 主要仪器 细胞恒温培养箱(型号为MCO175)，SANYO 公司生产；生物安全柜(型号为Biobase BSC-1100IIA2-X)，BioBase 公司生产；倒置显微镜(型号为Ti-E)，Nikon公司生产；普通离心机(型号为Micro-17 )、冷冻离心机(型号为Theromo Fisher labofuge 400R)，均由Thermo Scientific公司生产；低温离心机(型号为Eppendorf 5424R)由Eppendorf公司生产；普通PCR仪(型号为T100)、凝胶成像系统(型号为GeIDoc XR + )，均由Bio-Rad公司生产；荧光定量PCR仪(LightCycler®96)，由罗氏公司生产；化学发光和多色荧光成像系统(FluorChem M)，由美国ProteinSimple公司生产；水平电泳槽、电泳仪(型号为BG-MIDI)，均由北京百晶生物技术有限公司生产；隔水式电热恒温培养箱(型号为GRP-9080)，上海培因实验仪器有限公司生产；恒温摇床(型号为ZWY-240)，太仓市科教器材厂华利达实验设备公司生产。

2 方法

2.1 引物的设计 从NCBI上查找目的基因mRNA序列，由于没有番鸭序列，所以根据绿头鸭Viperin (登录号为KP198582.1) mRNA序列设计克隆引物1对，在5′端和3′端分别引入EcoRⅠ(GAATTC)和BamHⅠ(GGATCC) 酶切位点；再设计RT-PCR 引物1对。根据MDRV的结构蛋白P10 (登录号为 EF547375.1) mRNA 序列设计RT-PCR引物1对。根据人GAPDH (登录号为KJ891221.1) mRNA 序列设计RT-PCR 引物1对。根据番鸭actin(登录号为 KY352479.1) mRNA序列设计RT-PCR 引物1对。

设计的引物序列见表1。

表1 引物序列信息

h：人源引物 ； d：鸭源引物

2.2 番鸭Viperin 编码区序列的PCR扩增 从番鸭脾脏中提取总RNA，然后反转录获得cDNA。以此cDNA 为模板，PCR扩增Viperin编码区序列。PCR反应条件: 95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 个循环；72 ℃再延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳跑胶，回收目的条带。

2.3 真核表达载体的构建 将PCR扩增获得的Viperin基因和pFlag-CMV-5a 载体分别经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后纯化、回收，再用T4 DNA 连接酶将目的片段和载体的双酶切产物在16 ℃条件下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，通过琼脂糖凝胶电泳跑胶筛选重组质粒。

2.4 克隆质粒的鉴定EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒，电泳鉴定；并将重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将构建成功的含番鸭Viperin基因质粒命名为pFlag-CMV-Viperin。

2.5 真核表达质粒的转染 待293T 细胞密度为80%～90%时，将旧培养基更换成转染液( 无血清无双抗的DMEM培养基)，取3 μg pFlag-CMV-Viperin，加入转染液中至总体积为50 μL，轻轻混匀；取VigoFect 2μL，加入转染液中至总体积为50 μL，轻轻混匀，室温放置5 min；将含有VigoFect的转染液逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，室温放置20 min；将混合液逐滴加入细胞中，轻轻摇匀，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h后更换成完全培养基，继续培养24 h，获得过表达Viperin和空载体pFlag-CMV-5a的293T细胞。这两种细胞感染同剂量的MDRV(MOI为1)，收集感染24 h后的细胞，提取RNA，反转录获得cDNA，用RT-PCR和qRT-PCR检测细胞中Viperin的表达量和病毒基因P10的表达水平。

2.6 RT-PCR检测Viperin基因的表达 提取细胞/组织RNA，并反转录获得cDNA。以此cDNA 为模板，PCR扩增Viperin、P10和GAPDH /actin基因。PCR反应条件为：9 5℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃再延伸10 min。以Actin为内参基因，1.2%琼脂糖凝胶电泳跑胶，观察目的条带的灰度值，进而分析判断目的基因mRNA 的表达情况。

2.7 Western-Blot检测Viperin蛋白的表达 收获细胞后提取细胞总蛋白。10% SDS-PAGE电泳分离目的蛋白并转膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗用1×TBS 适当稀释，室温下摇动孵育2～4 h；二抗用3%脱脂牛奶稀释，室温下摇动孵育2～4 h。用1×TBS洗膜3次，10min/次；最后用化学发光显色液冲洗膜5 min，曝光并分析结果。

3 结果与分析

3.1 MDRV感染能够诱导Viperin高表达 MDRV感染293T细胞和MDEF细胞，分别感染不同时间后收集细胞样品，提取RNA，检测Viperin的变化情况。结果显示，随着病毒复制量的增多，Viperin表达量也呈上升的趋势(图1A、B)。此外，用MDRV感染5日龄的雏番鸭，总感染时间为4 d，每隔1 d处死番鸭并收取脾脏来检测病毒P10和Viperin的表达量。结果显示，番鸭脾脏中Viperin的表达量在MDRV感染后有明显的升高，与细胞水平一致(图1C)。由此说明Viperin的表达与MDRV的增殖可能有着一定的关系。

图1MDRV感染293T、MDEF和番鸭后P10和Viperin表达量

3.2 重组质粒pFlag-CMV-Viperin的构建 为了进一步研究Viperin基因在MDRV感染机体过程中发挥的作用，我们构建了番鸭Viperin基因真核表达质粒：采用RT-PCR方法从番鸭脾脏组织中扩增得到1条长度约为1 000 bp的特异条带(图2)，与预期片段大小相符。利用EcoR I 酶和BamH I 酶双酶切PCR获得的Viperin基因片段，同时用这2种酶双酶切pFlag-CMV-5a载体，将回收的基因片段与载体片段连接，转化后提取质粒，再利用限制性内切酶EcoR I和BamH I对质粒进行双酶切鉴定，可以获得预期约1 100 bp大小的目的片段(图3)。最后，将该质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序得到的质粒基因序列与绿头鸭Viperin的基因序列相似度为97.12%，说明重组质粒构建成功，将其命名为pFlag-CMV-Viperin。

图2 番鸭Viperin编码区序列的PCR扩增

图3 重组质粒pFlag-CMV-Muscovy-Viperin的酶切鉴定

3.3 重组质粒蛋白表达水平的检测 由于番鸭鸭胚成纤维细胞无法传代培养，且原代细胞转染效率较低，因此选择在293T模式细胞中检测番鸭Viperin重组质粒的表达情况。pFlag-CMV-Viperin重组质粒转染293T细胞24 h后收取细胞制备蛋白样，Western-Blot 检测Viperin蛋白表达水平。pFlag-CMV-Viperin带有Flag标签，因此一抗采用Flag标签抗体。结果显示，pFlag-CMV-Viperin重组质粒能够在293T细胞中大量表达(图4) 。

图4 Viperin 蛋白表达水平的检测

3.4 番鸭Viperin蛋白具有抗MDRV增殖的作用 基于成功构建了过表达番鸭Viperin的质粒，我们对其在MDRV复制过程中的功能进行了研究。将pFlag-CMV-Viperin和空载体pFlag-CMV-5a分别转染至293T细胞，24 h后感染MDRV(MOI =1)，感染24 h后收样，提取总RNA，用RT-PCR和qRT-PCR检测细胞中病毒P10基因的表达情况。结果表明，转染pFlag-CMV-Viperin的P10基因表达量明显低于对照组。因此说明，番鸭Viperin蛋白对MDRV的增殖起到抑制作用(图5)。

图5 过表达Viperin抑制了MDRV在293T细胞中的复制

4 讨论

番鸭呼肠孤病毒病在福建、广东和浙江等多个省份暴发，对我国番鸭养殖业造成了重大的经济损失[15]，研制高效低毒的抗MDRV药物势在必行。先天免疫因子Viperin是一种可被干扰素、多种病毒、细菌脂多糖(LPS)等诱导表达的与内质网相关的抗病毒蛋白，具有广谱抗病毒活性。Viperin在抑制包括DNA和RNA病毒，细菌和寄生虫在内的广泛的微生物入侵中扮演着重要角色。

本研究发现番鸭Viperin基因在感染MDRV的细胞和组织中大量表达，为了探明该现象与病毒复制的相关性，我们构建了番鸭Viperin 基因真核表达质粒，对其功能进行了研究。结果发现，番鸭Viperin蛋白在MDRV感染过程中发挥了重要作用：能够显著抑制MDRV的复制。后续工作可以聚焦于番鸭Viperin蛋白具体的作用机制及其调控的相关信号通路，以期更加全面地了解番鸭Viperin蛋白抗MDRV的分子机制。这将为阐明MDRV与宿主相互作用机制及病毒的致病机理提供重要科学依据，同时也为新型抗MDRV药物的研发提供理论参考。